[发明专利]构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及在基于痘苗病毒高度减毒毒株MVA的活载体疫苗的构建中，一种穿梭质粒的设计与应用，特别涉及一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体。

背景技术

MVA(modified vaccinia virus Ankara改良型痘苗病毒安卡拉株)是高度减毒的痘苗病毒毒株，是在人类寻求高度减毒的痘苗病毒作为天花疫苗的过程中获得的。来源于一个土耳其的痘苗病毒毒株CVA(chorioallantois vaccinia virus Ankara)。CVA在鸡成纤维细胞中传代371代后，发现其生长特性已经发生了改变，在传代516代后改名为MVA。与CVA相比，在鸡成纤维细胞中传代570代以后，MVA失去了在绝大部分哺乳动物细胞中感染和复制的能力。分析基因图谱发现，在传代的过程中MVA丢失了大约30KB的病毒基因，这些基因大多与病毒的毒力和宿主选择范围密切相关。在体外研究中发现，当痘苗病毒感染细胞后，早期基因转录导致病毒DNA复制，之后调节基因和晚期基因表达。继而，病毒DNA被包装到不成熟的蛋白粒子中成为有感染性的细胞内成熟的粒子。MVA在允许细胞(BHK-21，CEF等)内可以完成完整的生活周期，而在非允许细胞中，停止在了这个过程的某个步骤之中。在人细胞内，MVA起始了复制，但是不能 繁殖生长而产生有感染性的成熟颗粒，从而使之具有了良好的安全性。

MVA作为活载体疫苗的载体具有以下几点优势：(1)MVA在传代过程中丢失了六个主要的基因，在这六个删除基因的部位可以用来插入外源基因，并且在外源基因插入后并不影响病毒本身的感染能力和表达能力。(2)免疫原性高。外源蛋白基因在被病毒载体递送到体内后，基因被忠实表达，并且能够进行正确的转录、翻译和翻译后的加工与修饰。表达的蛋白具有天然的构象与生物活性。较蛋白疫苗相比，能够诱导机体产生强而持久的体液免疫和细胞免疫应答。(3)MVA作为天花疫苗，在上个世纪七十年代，在消灭天花的战役中，成功的用于预防天花。并且已经对超过120000人进行了免疫，这些接受MVA接种的人群只有小部分人有轻度的与之相关的副反应发生(如：红肿、发热和流感样症状)。MVA已经在动物模型和人体试验中得到了很好的安全性评价，没有引发任何的由于接种引起的严重临床疾病。总的来说，MVA稳定性好，安全性高，并且能表达大的外源蛋白。MVA可以模仿病毒感染，产生适当的危险信号，并且诱导强而持久的细胞免疫应答。这种复制缺陷的病毒提供了灭活疫苗的特性但是却有活疫苗的免疫原性，使之成为活载体疫苗的重要候选病毒。

目前以MVA为活病毒载体正在进行临床研究的主要是由四种病原物质引起的感染性疾病和肿瘤，分别是：HIV，HCV，HPV和结核分枝杆菌。到2012年底，以针对HIV感染的MVA为活载体的疫苗大约有10个分别进入I期或II期临床研究。针对HPV引起的子宫颈癌 的治疗的MVA活载体疫苗有2个进入了II期临床研究。针对HCV感染的MVA活载体疫苗有两个已经进行到II期临床研究，此外还有一个针对HBV感染的MVA疫苗进入了IIa期临床研究，一个结核杆菌的MVA疫苗进入了I期临床。

鉴于此，快速准确的构建携带有外源目标基因的MVA病毒成为病毒载体疫苗的各项工作的首要任务。MVA基因组庞大，外援基因的引入主要依靠病毒基因组与携带有外源目标基因的穿梭载体之间的随机同源重组来完成。穿梭载体在与MVA基因组发生同源重组获得重组MVA病毒后，随同目的基因转入载体的还有标记基因。利用标记基因可以从大量非转化细胞中将阳性重组克隆筛选出来。但随着重组病毒的传代，标记基因变得不再用，却仍在细胞内表达。这些基因一旦进入机体，对机体的影响很难确定，产生安全性隐患。同时也是在今后药品报批等过程中所不允许的。因此，构建带有标记基因自删除系统的穿梭质粒，在痘苗病毒MVA的应用中的基础与关键。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭质粒载体，带有标记基因自删除系统的同时又能转染和表达外源基因。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能插入外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动插入的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，还携带有两端带有同源序列的自删除标 记基因系统。