[发明专利]利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法

权利要求书

1.一株生产用于不对称转化制备(R)-苯乙醇的孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015099。

2.利用权利要求1所述的重组酿酒酵母生产(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶的方法，其特征在于

YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH 7.0，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；

YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；

产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制；

培养条件：挑取重组酿酒酵母CCTCC NO：M2015099的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h；取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，用显微镜镜检产孢效率；产孢完成后，6000 rpm、10 min离心收集菌体并以pH 6.5的少量磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理1 h，工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s后，离心收集孢子，即得(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶，待用。

3.利用权利要求2所述方法制备的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法，其特征在于将改造后的突变基因E228S通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S转入酿酒酵母AN120中，利用诱导培养获得的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶；以苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL pH5.0~5.5的0.1 mol/L醋酸缓冲液，或1 mL pH 6.0~7.5的0.1 mol/L磷酸缓冲液，或1 mL pH 8.0~9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中，孢子浓度为0.1 g/mL，苯乙酮底物浓度为6 g/L，及与苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度30℃，反应时间5 h。

4.权利要求3所述的不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法，其中所述的重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建方法，其特征在于：

YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；

SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；

培养条件：挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL 组成为1M DTT 10 μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL的 Buffer重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建：

利用限制性内切酶PstI 和XhoI，质粒pET-28a- scrII/E228S与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，经切胶回收浓缩后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr- scrII/E228S。