[发明专利]利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法

说明书

技术领域

利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法，本发明涉及蛋白质工程技术改造(S)-羰基还原酶II催化苯乙酮的底物选择性，通过基因工程技术构建重组酿酒酵母突变株，诱导培养使酵母产生子囊孢子包埋突变蛋白，形成微胶囊酶，高效制备(R)-苯乙醇，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

手性化合物作为手性合成的中间体，在医药、农药、和食品添加剂等精细化工中应用广泛。羰基还原酶催化合成手性醇时，一般仅能催化其天然底物，这就要求对野生型羰基还原酶进行理性改造，赋予其新的催化功能，能催化非天然底物，获得非天然的手性产物。

定点突变技术可以有效改变(S)-羰基还原酶II催化的底物选择性。通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法，选择(S)-羰基还原酶II的底物结合域中关键氨基酸位点实施突变，构建相应的突变株，可有效提高其催化苯乙酮底物的效率。

酿酒酵母以其安全、蛋白表达调控等优势逐渐成为优良的表达宿主。当酵母细胞在营养匮乏时产生具有四层网状膜结构的子囊孢子，以抵御外界不良环境，同时拦截外源大分子，只允许小分子物质（底物、产物和辅酶等）进出孢子，为孢子内胶囊酶提供一个相对独立，几乎无外酶干扰的催化内环境。因而酵母孢子是一种极具潜力的酶固定化载体。

本实验室定点改造了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCC NO：M203011的(S)-羰基还原酶II，获得了重组菌株Escherichia coli BL21/pET-E228S。研究发现该突变体具有催化非天然底物苯乙酮的活性。在此基础上，将突变基因克隆至酿酒酵母AN120中表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质诱导培养产生孢子，包埋突变蛋白，形成微胶囊酶。以微胶囊酶为生物催化剂，苯乙酮为底物进行生物转化。该微胶囊酶不仅能高效手性转化，而且环境具有很好的耐受性；同时，微胶囊酶连续使用20批次后仍能保持较高水平的转化效率。本发明通过基因工程技术构建微胶囊酶，成功克服了(S)-羰基还原酶II底物选择性差及酶蛋白对环境耐受性差的缺陷，从而实现了微胶囊酶高效不对称转化制备(R)-苯乙醇。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种蛋白质工程技术改造的微胶囊酶，利用重组酿酒酵母(菌种保藏号：CCTCC NO:M2015099)不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法。本发明目的在于根据已经解析出来的蛋白结构，利用定点改造技术，基因工程法将突变体表达于酿酒酵母AN120孢子中，形成微胶囊酶，改变该酶的立体选择性和产物空间对映性，提高酶的使用批次。该微胶囊酶不对称还原苯乙酮制备光学活性(R)-苯乙醇，连续使用20批次后，产物光学纯度高达99％，转化率高于81%。对(S)-羰基还原酶II进行定点突变后进行微胶囊化，不仅开发了该酶的催化转化非天然产物的新功能，而且显著提高了酶的催化稳定性，为工业上高效、低成本制备光学纯(R)-苯乙醇奠定了坚实的基础。

（2）技术方案：一株生产用于不对称转化制备(R)-苯乙醇的孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015099。

利用所述的重组酿酒酵母生产(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶的方法，在于：

YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH 7.0，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；

YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；

产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制；