[发明专利]一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法

权利要求书

1.一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将菌种接入2216L培养基中培养后，提取基因组DNA；所述菌种为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)MCCC 1B00241；

(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板扩增如SEQ ID 01所示的苯丙氨酸脱氢酶基因序列，并装载到pET28a载体上，转入大肠杆菌中即得到工程菌；

(3)将步骤(2)所得工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液；

(4)在步骤(3)所得细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化反应得到产物手性苯丙氨酸，上述反应条件为：pH 7～13，反应温度20℃～50℃下，震荡速率100～300rpm，反应时间24～168h；体系中NADH的量为浓度1～1.5mM的溶液0.05～0.07mL，所述苯丙酮酸在反应体系中的的终浓度为0.02～0.5mol/L，所述氨基供体为终浓度0.05～1mol/L的氨水、NH₄Cl、NH₄NO₃或甲酸铵，所述辅助底物为终浓度0.001～1mol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖何异丙醇中的至少一种，所述缓冲液为0.01～0.2mol/L的pH为7～13的NH₄Cl-氨水，Tris～盐酸、乙酸钠溶液、碳酸钠溶液或磷酸钾溶液。

2.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所属步骤(1)的培养的条件为：起始pH 6.5～8.0，装液量体积分数为5％～15％，培养温度20～40℃，摇床转速150～250rpm，培养时间12～48h。

3.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)的扩增所用引物为Bs-F和Bs-R，引物序列分别如SEQ ID 02和SEQ ID 03所示。

4.如权利要求3所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述扩增具体为：反应体系：22μL H₂O，1μL Bs-F，1μL Bs-R，1μL总DNA，25μL PrimeSTAR Max Premix；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸6s，循环30次，72℃延伸10min。

5.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中卡那霉素的接种前终浓度为50～150ug/mL，所述培养的条件为：37℃，150～250rpm培养1.5～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养5～6h。

6.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)的细胞液的浓度为0.025～130g/L。

7.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述氨基供体为终浓度0.1～1mol/L的氨水或NH₄Cl。

8.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述辅助底物为终浓度0.05～1mol/L的葡萄糖和/或甘油。

9.如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述缓冲液为0.01～0.2mol/L的pH为8的NH₄Cl-氨水。