[发明专利]一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于苯丙氨酸制备技术领域，具体涉及一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法。

背景技术

手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D～氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)的制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化还原酶的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研究的热点。

苯丙氨酸主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分。L～苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体和良好载体，通过L～苯丙氨酸可以把抗肿瘤药物载入肿瘤所在的部位，不但可以抑制肿瘤生长，而且又可降低肿瘤药物的毒性。随着甜味剂二肽阿斯巴甜(APM)投放市场，L～苯丙氨酸作为它的主要原料，需求量急剧增加。D～苯丙氨酸营养价值虽小，但具有出色的镇疼作用。临床实验已表明，对一批长期用各种疗法无效的肌肉疼、关节疼、腰腿疼患者疗效显著，并且无明显副作用。

苯丙氨酸在人体内不能合成，必须由外界供给，因此研究其合成方法很有必要。苯丙氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵法。化学合成法的收率较低；需使用剧毒的氰化物，污染环境；副反应较多；工艺路线长等缺点。而微生物发酵法具有环境友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法。本发明利用全细胞中苯丙氨酸脱氢酶的高度对映体选择性，催化苯丙酮酸的不对称还原胺化，获得L～苯丙氨酸，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下：

本发明的具体技术方案如下：

一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将菌种接入2216L培养基中培养后，提取基因组DNA；所述菌种为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)MCCC 1B00241，该菌株购自福建厦门国家海洋局第三研究所；

(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板扩增如SEQ ID 01所示的苯丙氨酸脱氢酶基因序列，并装载到pET28a载体上，转入大肠杆菌中即得到工程菌；

(3)将步骤(2)所得工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液；

(4)在步骤(3)所得细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化反应得到产物手性苯丙氨酸，上述反应条件为：pH 7～13，反应温度20℃～50℃下，震荡速率100～300rpm，反应时间24～168h，体系中NADH的量为浓度1～1.5mM的溶液0.05～0.07mL，所述苯丙酮酸在反应体系中的的终浓度为0.02～0.5mol/L，所述氨基供体为终浓度0.05～1mol/L的氨水、NH₄Cl、NH₄NO₃或甲酸铵，所述辅助底物为终浓度0.001～1mol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖何异丙醇中的至少一种，所述缓冲液为0.01～0.2mol/L的pH为7～13的NH₄Cl-氨水，Tris～盐酸、乙酸钠溶液、碳酸钠溶液或磷酸钾溶液。

在本发明的一个优选实施方案中，所属步骤(1)的培养的条件为：起始pH 6.5～8.0，装液量体积分数为5％～15％，培养温度20～40℃，摇床转速150～250rpm，培养时间12～48h。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)的扩增所用引物为Bs-F和Bs-R，引物序列分别如SEQ ID 02和SEQ ID 03所示。

进一步优选的，所述扩增具体为：反应体系：22μL H₂O，1μL Bs-F，1μL Bs-R，1μL总DNA，25μL PrimeSTAR Max Premix；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸6s，循环30次，72℃延伸10min。