[发明专利]一种提高SSR分子标记扩增和检测效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地涉及SSR分子标记检测应用，更具体地，涉及一种提高SSR分子标记扩增和检测效率的方法。

背景技术

随着现代分子生物学的快速发展，分子标记技术已广泛应用于遗传育种、物种亲缘关系鉴别、基因组作图、基因定位、基因库构建、基因克隆等许多研究领域。PCR扩增的检测技术是试验成功的制约条件，也是技术难度最大、最复杂的环节。SSR分子标记是基于PCR扩增的分子标记，为共显性标记，具有单基因座、等位基因变异多、多态性丰富、操作简单、稳定性好等优点。目前，SSR分子标记已经成为重要的遗传标记之一，被广泛应用于植物指纹数据库构建、分子辅助育种、遗传多样性分子、基因定位以及品种纯度鉴定等方面。目前，SSR分子标记试验体系主要包括基因组DNA的提取、SSR标记PCR的扩增和PCR产物的电泳检测。传统的SSR分子标记的PCR扩增程序为：94℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃50s，35个循环；72℃5min；时间为大约为2.5h。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺的作用下聚合而成，它通过改变凝胶总质量浓度或单体与交联剂的比例控制空洞大小，能分离、定性及定量分析蛋白质、多肽、核酸等高分子化合物。聚丙烯酰胺凝胶包括非变性聚丙烯酰胺和变性聚丙烯酰胺，非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化双链DNA片段，变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化单链DNA片段。SSR标记PCR产物的检测采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，包括制胶凝胶、预电泳、上样、电泳、染色等步骤，耗时超过4小时。传统的单次点样法制备凝胶，预电泳、电泳、银染显色所需实验试剂耗费多，操作步骤繁琐复杂，费时费工，从而限制了其进行大规模分子标记分析时的效率。如果采用100孔的电泳孔，那么检测100个样品的扩增和电泳过程需要总体耗时超过6小时。这种检测效率对于大规模样本的基因型检测显然时间过长，费用也较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高SSR分子标记扩增和检测效率发方法，以简化检测步骤、节约检测成本，缩短检测时间，从而提高大规模SSR分子标记分析的工作效率。

本发明提供的一种提高SSR分子标记扩增和检测效率的方法，包括以下步骤：

(1)基因组DNA的提取；

(2)SSR分子标记的PCR扩增；所述PCR扩增包括2个不同的循环程序；

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用六次点样法；所述六次点样法为同一个加样孔中分时段先后6次加入不同的PCR产物；

(4)银染显色。

其中，步骤(2)中PCR扩增方法为：94℃3min；94℃30s，53-62℃30s，72℃30s，15个循环；94℃20s，53-62℃20s，72℃30s，20个循环；72℃5min。

进一步地，步骤(2)中PCR扩增方法为：94℃3min；94℃30s，56-60℃30s，72℃30s，15个循环；94℃20s，56-60℃20s，72℃30s，20个循环；72℃5min。

在本发明的实施例中，优选地，步骤(2)中PCR扩增方法为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，15个循环；94℃20s，58℃20s，72℃30s，20个循环；72℃5min。

本发明的方法中，步骤(3)在点样之前的进行预电泳时间是45-65min，使电泳缓冲液的温度达到48-53℃。

优选地，步骤(3)中，在点样之前进行预电泳，使电泳缓冲液的温度达到50℃。

步骤(3)中电泳条件为2000V，100mA，80W恒功率电泳。

步骤(3)所述六次点样法为在预电泳结束后，向点样孔中加入扩增产物，开始第一次点样，电泳5-20min之后进行第二次点样，电泳时间与第一次相同，之后进行第三次电泳，电泳时间比第二次缩短1min，以此类推，至第五次点样后电泳时间比第4次的电泳时间缩短1min；第六次点样之后，电泳20-40min，结束电泳。