[发明专利]一种抗氧化的多糖-多肽纳米颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及高分子口服输送载体制备的技术领域，具体涉及一种新型的、具有抗氧化活性的高分子纳米颗粒的制备方法。

背景技术

制备高分子纳米载体包封药物和食品功能因子是增强其生物利用率的有效方式之一。许多不稳定的药物和食品功能因子在生产、贮藏和体内输送过程中容易氧化是导致其失效的主要原因之一。因此，制备具有抗氧化功能的高分子纳米输送载体非常重要，受到了越来约多的关注。壳聚糖是一种无毒、生物可降解、生物相容性强的正电荷天然聚合电解质，已经被广泛地应用于食品、化妆品、生物医学和制药等领域。壳聚糖纳米颗粒能够吸附到黏膜表面，并且迅速打开上皮细胞之间紧密的黏结，能够避开肠道清除机制的作用，在人体肠道中具有较长的保留时间；最近的研究还表明完整的壳聚糖纳米颗粒能够被人体细胞吞噬，从而显著地提高其包封的药物分子的生物利用率。没食子酸是一种天然存在的酚酸，具有很强的抗氧化活性。天然植物中含有大量的结合态的酚类物质。这些酚类物质与植物细胞壁的主要结构成分，如纤维素，半纤维素，木质素，果胶等多糖通过共价作用结合在一起。受此启发，我们将没食子酸接枝到壳聚糖分子链中，制备具有抗氧化活性的没食子酸接枝壳聚糖共聚物。应用没食子酸接枝壳聚糖共聚物与酪蛋白磷酸肽之间的相互作用，制备新型的高分子纳米颗粒。

发明内容

本发明旨在提供一种新型的、具有抗氧化活性的多糖-多肽纳米颗粒的制备方法。这种纳米颗粒能够应用于医药、食品工业中，作为药物和食品功能因子的口服输送载体。本发明应用碳二亚胺和羟基苯并三氮唑介导将没食子酸接枝到壳聚糖分子链上。应用薄层层析、紫外光谱和红外光谱表征没食子酸接枝壳聚糖共聚物。通过Folin-Ciocalteau法测定没食子酸接枝壳聚糖中没食子酸的接枝率。通过没食子酸接枝壳聚糖与酪蛋白磷酸肽分子间自组装，制备新型的纳米颗粒。应用动态光散射、电位仪和透射电子显微镜表征纳米颗粒的结构。分别应用二苯基苦肼基(DPPH)自由基法和β-胡萝卜素-亚油酸法研究发现该新型的纳米颗粒具有较强的抗氧化活性。本发明的工艺方法具有反应条件温和、成本低、对环境友好等优点。制备的高分子纳米颗粒自身具有抗氧化活性，因此，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒(NP1)和没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒(NP2、NP3、NP4分别代表没食子酸接枝率为26.5±1.0，113.7±1.1，126.0±1.1mg/g)的粒径(A)、电位(B)和表面形态(C、D，接枝率为113.7±1.1，126.0±1.1mg/g的没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒)。

图2没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒对DPPH自由基和亚油酸自由基(B)的清除活性。

具体实施方式

本发明的具体实施方案如下：

1、一种抗氧化的多糖-多肽纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)、将壳聚糖(0.303g，1.85mmol)和羟基苯并三氮唑(0.282g，1.85mmol)共溶于30mL去离子水中，搅拌过夜，直至溶液澄清透明；

(2)、将没食子酸(0.311g，1.85mmol)逐滴加入壳聚糖溶液中，然后逐滴加入2mL的1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基亚胺)盐酸盐(EDC HCl)的乙醇溶液(0.355g，1.85mmol)；

(3)、调节壳聚糖中氨基葡萄糖单元与没食子酸的比例(1∶0.1，1∶1，1∶3和1∶5)，以合成具有不同没食子酸接枝率的没食子酸接枝壳聚糖共聚物；

(4)、将壳聚糖与没食子酸的混合物在室温(25℃)、避光条件下反应24小时；

(5)、反应结束后，将反应的混合物倒入透析袋(MWCO 3,500Da)中，透析6天，每天换四次水；

(6)、透析结束后，将合成的没食子酸接枝壳聚糖共聚物进行冷冻干燥，得到干燥的样品；

(7)、将步骤(6)中制备的没食子酸接枝壳聚糖共聚物溶于1％的醋酸溶液，直至完全溶解，调节pH到6.2；

(8)、将酪蛋白磷酸肽溶于去离子水中，调节溶液pH为6.2；

(9)、搅拌条件下，将步骤(7)中的没食子酸接枝壳聚糖共聚物溶液逐滴加入步骤(8)中的酪蛋白磷酸肽溶液中，直至壳聚糖与酪蛋白磷酸肽质量比为1∶1，溶液呈现乳光，制备纳米颗粒。

(10)、分别应用DPPH自由基和亚油酸自由基法测定制备的没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒的抗氧化活性。

2.没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒。由Folin-Ciocalteu反应结果计算得出，在氨基葡萄糖与没食子酸比例为1∶0.1，1∶1，1∶3和1∶5的条件下，没食子酸接枝壳聚糖共聚物中没食子酸的接枝率分别是26.5±1.0，113.7±1.1，126.0±1.1和122.6±2.2mg/g。没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒特征是：粒径300nm，表面Zeta电位30mV球形规则、分布均匀。没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒对DPPH自由基和亚油酸自由基的清除能力随没食子酸接枝率的增加而提高，同时，随着纳米颗粒浓度的提高而增强。接枝率为126.0±1.1mg/g的没食子酸接枝壳聚糖-酪蛋白磷酸肽纳米颗粒在1.0mg/mL浓度下对DPPH自由基和亚油酸自由基的清除能力分别达到85％和90％。