[发明专利]一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，属于病毒分子生物学领域。

(二)背景技术

水貂病毒性肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)可引起水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)，水貂病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率，是世界公认的危害水貂养殖业的重要病毒性传染病之一，严重妨碍了养貂业的健康发展。因此，及时快速检测水貂病毒性肠炎病毒，在生产实践中具有重要的作用，对水貂病毒性肠炎的预防具有重大意义。

目前在实际生产中，检测水貂病毒性肠炎病毒常用的方法有间接免疫荧光技术、琼扩试验、血凝/血凝抑制试验以及ELISA等，这些方法存在或敏感性不高、或特异性不强等缺点。随着分子生物学和生物试剂的不断发展和改善，PCR检测方法已经成为病毒检测的重要技术。因此可以针对MEV的结构蛋白(VP2)和非结构蛋白(NS1)设计两对引物，建立PCR方法对MEV进行检测。目前，在我国水貂群中MEV普遍存在，应用双重PCR方法检测MEV的方法还没有建立，所建立的检测MEV的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性高的高通量检测方法，为MEV的检疫提供一种新的检测方法。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测水貂病毒性肠炎病毒的双重PCR方法，是一种用于非疾病诊断目的的快速检测方法，主要涉及一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物。本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测MEV的双重PCR方法，特异性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行MEV的检测。

一组用于快速检测水貂病毒性肠炎病毒的特异性引物，是通过对GenBank上已发表的MEV的基因序列进行比对，选择在MEV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4。

SEQ.ID.NO 1：5’-GGTTAGCTAAACATGGTTATG-3’；

SEQ.ID.NO 2：5’-GAGTCAGAGGAGTTAGAACG-3’；

SEQ.ID.NO 3：5’-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3’；

SEQ.ID.NO 4：5’-GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3’。

所有引物以无菌ddH₂O(Rnase free)配成20pmol/μl的浓度备用。

上述引物的使用方法如下：

A、以MEV DNA为模板进行PCR反应。反应体系为：17.3μl ddH₂O(Rnase free)，2.5μl Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10min。

B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：

如果同时扩增出了191bp和824bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有MEV；如果只扩增出扩增出191bp或824bp的产物，则该样品可疑；如果未扩增出191bp和824bp的产物，则该样品不含有MEV。

本发明的双重PCR方法最低可检测到10²个拷贝MEV的病毒DNA，表明本方法具有很高的灵敏性。

用建立的双重PCR方法对威海、诸城、菏泽、临沂、大连等地30个水貂养殖场场送检的72只MEV分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的双重PCR方法适合于MEV的快速检测。

(四)附图说明

图1单重PCR的特异性检测结果