[发明专利]一种检测食树脂新鞘氨醇菌的引物及定量检测方法

权利要求书

1.一种食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum) 的定量检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum) 的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，经纯化后，与载体连接后转化感受态细胞DH5α，涂含氨苄抗生素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，经验证后，制得标准检测溶液原液，经紫外分光光度计测定浓度并换算拷贝数，换算公式：

DNA拷贝数=（6.02×10²³）×（DNA浓度×10^-9）/（DNA长度×660）

所述DNA拷贝数单位为：copies/μl，DNA浓度单位为：ng/μL；

（3）将步骤（2）制得的标准检测溶液原液按照10倍梯度稀释，获得不同浓度的稀释液，以获得的稀释液为扩增模板，通过定量PCR扩增，得到扩增标准曲线如下：

y=-3.459log（x）+43.197；

其中，y 为Ct值，x为质粒DNA拷贝数浓度；

（4）取待检测样品，提取待测样品基因组DNA，制得待检测扩增模板，按照步骤（3）中定量PCR扩增的条件，检测样品的Ct值，Ct值为循环阈值，对照标准曲线，得出待检测样品中食树脂新鞘氨醇菌的DNA浓度；

所述步骤（3）和步骤（4）中定量PCR扩增体系如下，共25μL：

含SYBR GreenI 的2×SuperReal PreMix 10μL，浓度10mM正向引物0.5μL，浓度10mM反向引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O 12μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性15min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，共40个循环；

上述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增体系如下，共50μL：

10×PCR缓冲液5μL，2.5mM Mg²⁺ 4μL，4μL dNTPs各2.5mM，浓度10mM权利要求1所述正向引物1μL，浓度10mM权利要求1所述反向引物1μL，模板DNA 2μL ，5U 的Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

3.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的纯化为经质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶纯化；所述的LB平板中氨苄抗生素的含量为100μg/mL。

5.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的载体为PMD18T载体。

6.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的定量PCR扩增采用Bio-red定量PCR仪。

7.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中的定量PCR扩增的扩增模板体积与步骤（4）中的定量PCR扩增的待检测扩增模板体积相同。

8.如权利要求7所述的定量检测方法，其特征在于，所述扩增模板体积与待检测扩增模板体积均为2μL。