[发明专利]一种检测食树脂新鞘氨醇菌的引物及定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的引物及定量检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的烃类，具有普遍的细胞毒性、致畸性以及致癌性。由于其化学结构的稳定性以及极强的疏水性，决定了这类化合物在环境中能够长期稳定存在，难以用常规方法治理。随着工业科技的发展，大量的PAHs进入环境，这些PAHs极可能通过食物链的富集作用危害人类的健康。而利用微生物降解多环芳烃(PAHs)等持久性有机污染物的研究已成为当今环境科学的一个发展方向。

食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)属于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.)，新鞘氨醇杆菌属是环境中比较独特的一类新型的微生物资源，具有降解芳烃等污染物的特性，是优良的芳烃污染环境修复菌。该菌属的降解范围非常宽，从单环、多环芳烃到其它有机污染物都可以作为它们生长的碳源。由于这类降解菌既具有广泛的底物范围，又具有很高的降解率，所以应用到生物修复当中具有较大潜力。

目前，对于环境中食树脂新鞘氨醇菌的检测方法主要是依赖分离培养加分子鉴定，这种方法计数周期长、工作量大、检测数量不准确等，因而限制了食树脂新鞘氨醇菌在修复环境问题中的进一步研究应用。因此，迫切需要一种快速定量测定环境中食树脂新鞘氨醇菌检测方法。以为该菌的在环境中应用提供理论依据及技术支撑。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种检测食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的引物及定量检测方法。

本发明技术方案如下：

一种检测食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的引物，所述引物为一对，分别为正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

正向引物NF序列NF:5'-CATGCCGGTCGCGGATTTG-3'；SEQ ID NO.1

反向引物NR序列NR:5'-CACCTGTGCACGGTCCAGCC-3'；SEQ ID NO.2

一种食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的定量检测方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，经纯化后，与载体连接后转化感受态细胞DH5α，涂含氨苄抗生素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，经验证后，制得标准检测溶液原液，经紫外分光光度计测定浓度并换算拷贝数，换算公式：

DNA拷贝数(copies/μl)＝(6.02×10²³)×(DNA浓度(ng/μL)×10^-9)/(DNA长度×660)

(3)将步骤(2)制得的标准检测溶液原液按照10倍梯度稀释，获得不同浓度的稀释液，以获得的稀释液为扩增模板，通过定量PCR扩增，得到扩增标准曲线如下：

y＝-3.459log(x)+43.197；

其中，y为Ct值，x为质粒DNA拷贝数浓度；

(4)取待检测样品，提取待测样品基因组DNA，制得待检测扩增模板，按照步骤(3)中定量PCR扩增的条件，检测样品的Ct值(循环阈值)，对照标准曲线，得出待检测样品中食树脂新鞘氨醇菌的DNA浓度。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中PCR扩增体系(共50μL)如下：

10×PCR缓冲液5μL，2.5mM Mg²⁺4μL，4μL dNTPs(各2.5mM)，上述正向引物1μL(10mM)，上述反向引物1μL(10mM)，模板DNA 2μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，ddH₂O 32.5μL；

根据本发明优选的，所述步骤(2)中PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃延伸10min。