[发明专利]一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控所述aroB基因表达的RBS2、调控所述aroD基因表达的RBS3和调控所述aroE基因表达的RBS4；所述aroG的基因序列为SEQ ID NO:6所示，所述aroB的基因序列为SEQ ID NO:7所示，所述aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，所述aroE的基因序列为SEQ ID NO:9所示；

所述RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，所述RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，所述RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，所述RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述aroB基因与aroD基因之间还插入有终止子2，所述终止子2的基因序列为SEQ ID NO:11所示。

3.如权利要求1或2所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还包含

RiboJ基因，所述RiboJ的基因序列为SEQ ID NO:5所示。

4.如权利要求3所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述aroG基因与aroG基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroB基因与aroB基因的启动子之间插入有RiboJ基因、所述aroD基因与aroD基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroE基因与aroE基因的启动子之间插入有RiboJ基因。

5.一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将aroG、aroB、aroD和aroE基因分别插入载体pXMJ19，得到载体pXMJ19-aroG、pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19-aroE；

2)将aroG基因中的HindIII和PstI酶切位点，aroB基因中的BamHI和SpeI酶切位点，aroD基因中的PstI酶切位点，aroE基因中的EcoRI和SalI酶切位点进行突变，得到载体pXMJ19-aroGMU、pXMJ19-aroBMU、pXMJ19-aroDMU、pXMJ19-aroEMU；

3)将RiboJ基因插入载体pXMJ19，得到载体pXMJ19-RiboJ；

4)将荧光蛋白基因插入所述载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pZB；

5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以所述pXMJ19-aroGMU为模板扩增基因片段aroGMU，用引物MU-RBSAB-F和MU-RBSAB-R以所述pXMJ19-aroBMU为模板扩增基因片段aroBMU，用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以所述pXMJ19-aroDMU为模板扩增基因片段aroDMU，用引物MU-RBSAE-F和MU-RBSAE-R以所述pXMJ19-aroEMU为模板扩增基因片段aroEMU，所述MU-RBSAG-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGAATAGGGGTGTGAGTTG，所述MU-RBSAG-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTTACGCAGCATTTCTGCAACG，所述MU-RBSAB-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGAGCGCAGTGCAGATTTTC，所述MU-RBSAB-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述MU-RBSAD-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGCCTGGAAAAATTCTCCT，所述MU-RBSAD-R的基因序列为CGCGCGGTACCCTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述MU-RBSAE-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGGGTTCTCACATCACTCAC，所述MU-RBSAE-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTGTTCTTCTGAGATGCCT；

6)将步骤5)中扩增的基因片段aroGMU、aroBMU、aroDMU和aroEMU分别插入载体pZB，得到载体pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD和pZB-aroE；

7)步骤6)得到的载体分别转化大肠杆菌，对得到的克隆进行测序，将测序无误的所述载体pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD和pZB-aroE共同转化至Corynebacterium glutamicumRES167ΔaroK中，培养并检测荧光强度，Corynebacterium glutamicum RES167ΔaroK的菌株保藏号为CGMCC No.10678；

8)用引物aroG-H-F、aroG-H-R以所述pXMJ19-aroGMU为模板扩增基因片段aroG-H并插入所述载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pXMJ19-RiboJ-aroGMU-H；所述aroG-H的基因序列如SEQID NO:13所示,所述aroG-H-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGGTGAATCTATGAATAGGGGTGTGAGTTG，所述aroG-H-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTTACGCAGCATTTCTGCAACG；

9)用引物aroB-M-F、aroB-M-R以所述pXMJ19-aroBMU为模板扩增基因片段aroB-M；用aroD-M-F、aroD-M-R以所述pXMJ19-aroDMU为模板扩增基因片段aroD-M；用aroE-M-F、aroE-M-R以所述pXMJ19-aroEMU为模板扩增基因片段aroE-M；将扩增的基因片段aroB-M、aroD-M和aroE-M分别插入所述载体pXMJ19-RiboJ，获得载体pX MJ19-RiboJ-aroBMU-M、pXMJ19-RiboJ-aroDMU-M和pXMJ19-RiboJ-aroEMU-M；所述aroB-M、aroD-M和aroE-M的基因序列依次分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和S EQ ID NO:16所示，所述aroB-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGCATGTTCTATGAGCGCAGTGCAGATTTTC，所述aroB-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述aroD-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGCATGGCCGATGCCTGGAAAAATTCTCCT，所述aroD-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述aroE-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGAGAACGTGATGGGTTCTCACATCACTCAC，所述aroE-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTGTTCT TCTGAGATGCCT；

10)用引物PB-F、PB-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroBMU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroB-M；用引物PD-F、PD-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroDMU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroD-M；用引物PE-F、PE-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroEMU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroE-M，将基因片段Ptac-aroB-M插入所述载体pXMJ19-RiboJ-aroGMU-H，得到载体pXMJ19-GHBM；所述Ptac-aroB-M的基因序列如SEQ ID NO:17所示，所述PB-F的基因序列为CGCGGGATCCTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PB-R的基因序列为CGCGCCCGGGTTAGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述PD-F的基因序列为CGCGCCCGGGTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PD-R的基因序列为CGCGGGTACCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述PE-F的基因序列为CGCGGGTACCTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PE-R的基因序列为CGCGGAATTCTTAGTGTTCTTCTGAGATGCCT；

11)将片段Ptac-aroD-M插入所述载体pXMJ19-GHBM，得到载体pXMJ19-GHBMDM；所述Ptac-aroD-M的基因序列如SEQ ID NO:18所示；

12)将片段Ptac-aroE-M插入所述载体pXMJ19-GHBMDM，得到载体pXMJ19-GBDE；所述Ptac-aroE-M的基因序列如SEQ ID NO:19所示；

13)用引物Terminator2-F、Terminator2-R以pXMJ19为模板扩增终止子2，将终止子2和所述载体pXMJ19-GBDE分别用XmaI进行酶切，回收终止子2片段和载体pXMJ19-GBDE，将终止子2片段和载体pXMJ19-GBDE进行连接，得到载体pXMJ19-GBTDE，所述终止子2的基因序列为SEQ ID NO:11所示；

14)将所述pXMJ19-GBTDE转化至C.glutamicum RES167ΔaroK，获得产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，C.glutamicum RES167ΔaroK的菌株保藏号为CGMCC No.10678。