[发明专利]一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3和调控aroE基因表达的RBS4；RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了一种构建上述产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的方法及应用。本发明通过选择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，大大提高了莽草酸的产量。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

莽草酸(3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid,shikimicacid,SA)呈白色晶体状，比旋光度[α]＝-157°×cm3/g×dm-1，最大紫外吸收在235nm，其具有多种同分异构体，但只有α型的同分异构体具有生物学活性。莽草酸除可用于合成苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸外，还可用于合成维生素、己二酸等化合物。莽草酸可以通过化学合成、微生物发酵、植物萃取等手段获得。传统的莽草酸生产主要通过植物萃取进行，植物八角茴香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源。但由于八角茴香仅分布在全球极少数地区，其产量受气候、自然环境等因素的影响，因此严重限制了莽草酸的产量。化学合成莽草酸由于产率不高、工艺复杂、价格高昂因而未能广泛开展。利用微生物发酵生产莽草酸具有操作简单、能耗小、生产成本及低无污染等优点，在当今资源需求量较大、能源紧张、环保要求不断提高的情况下，展现了特有的优越性和广阔的发展空间。

现有的产莽草酸的菌株主要是通过对莽草酸途径基因改造的方式过表达途径中的aroG、aroB、aroD、aroE四个基因，虽然经过以上方法改造的菌株可以在一定条件下提升莽草酸的生产效率，但对莽草酸途径的改造策略只强调了过表达途径中的基因，而在翻译水平使用相同的RBS元件来控制基因的表达，限制了对莽草酸表达能力的进一步提高。例如：Chen等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量仅为1.85g/L(Chen K,Dou J,TangS,Yang Y,Wang H,Fang H,Zhou C(2012)Deletion of the aroK gene is essential forhigh shikimic acid accumulation through the shikimate pathway inE.coli.Bioresour Technol 119:141-7)。Cui等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量也仅为3.12g/L(Cui YY,Ling C,Zhang YY,Huang J,Liu JZ(2014)Production ofshikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomalevolution and cofactor metabolic engineering.Microb Cell Fact 13:21)。

发明内容

本发明的目的是提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，通过选择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，从而大大提高莽草酸的产量。

本发明提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3和调控aroE基因表达的RBS4；aroG的基因序列为SEQ ID NO:6所示，aroB的基因序列为SEQ IDNO:7所示，aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，aroE的基因序列为SEQ ID NO:9所示；