[发明专利]酶催化反应生产过氧乙酸的方法

说明书

技术领域

   本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从具有过水解活性的乙酰木聚糖酯酶AXE（Genbank：KC292495）由乙酸酯底物生产过氧乙酸。

背景技术

过氧乙酸（PAA），别名过醋酸、过氧化乙酸、乙酰过氧化氢，是过氧有机酸中结构简单，合成容易，相对稳定性较好的高活性、强氧化性有机酸。过氧乙酸的氧化能力高于过氧化氢，可作为杀菌消毒剂、氧化剂、环氧化剂，其具有独特的作用，是一种广谱、高效、速效、廉价的灭菌剂，广泛应用于医疗器械消毒、灭菌以及环境、物表、空气等疫原地消毒和预防性消毒。(韩双战,过氧乙酸的合成和应用.河北化工2008(6):41-43.)由于其结构中活性氧的存在，除了用作杀菌消毒剂外，过氧乙酸在造纸纺织、化学合成、环境工程、能源工程、聚合物工业及仿生化学领域都有广泛的应用研究，尤其是作为有机合成中的环氧化剂以及高效杀菌剂，有其突出的优良性能，开发利用前景广阔。（张腾云，等；过氧乙酸的合成及工业应用研究进展.化工进展2007(26):194-197）

过氧乙酸的合成方法有很多种, 但目前工业上采用的方法主要是过氧化氢法和乙醛氧化法两种。过氧化氢法是采用醋酸与过氧化氢反应，在强酸的催化作用下，制得过氧乙酸。常使用硫酸作为催化剂，反应过程剧烈，且往往需要高浓度醋酸，得到的过氧乙酸为强酸性。乙醛氧化法是在乙醛氧化生成醋酸的基础上，通过改变乙醛氧化的条件，降低反应温度，获得过氧乙酸。但此反应较复杂，要得到较高的转化率和过氧乙酸得率, 需加入适当的催化剂。且由于过氧乙酸具有强氧化性和腐蚀性，遇明火、高热会引起燃烧爆炸；与还原剂接触、遇金属粉木有燃烧爆炸危险，过氧乙酸的包装和运输及储存都有严格要求。（刘吉起，过氧乙酸的性质、制备和应用.河南预防医学杂志2004(03):171-173）

 因此，人们开始积极探索生物法生产过氧乙酸。酶法或者微生物法生产过氧乙酸的优点在于反应迅速、温和，不需要高浓度过氧化氢或底物，可以解决运输和储存等问题。酯酶和脂肪酶，其能催化酯水解，据报道常有与非血红素卤代过氧化物重叠的催化活性，能在过氧化氢存在下催化过氧化反应，产生过氧羧酸。反应如下：

                                                

例如， O.Kirk等（Biocatalysis,11:65-77(1994)） 研究了水解酶（脂肪酶、酯酶和蛋白酶）催化酰基底物与过氧化氢的过水解以形成过氧羧酸；近期已报道几种蛋白酶和脂肪酶组合原位产生浓度适于用作消毒剂和/或商业漂白剂的过酸（例如过乙酸）（美国专利申请11/413,246和11/588,523）。然而，大多数已知的利用酶生物催化生产的过氧乙酸浓度较低，不具备有效的应用价值。

实现生物法制备过氧乙酸，最重要的是获得一种易于获取、高活性、高表达的酶，才能达到生产效率高、反应迅速灵敏的要求，进而实现大规模生产。然而，此问题仍然是制约生物法制备过氧乙酸的关键问题。

发明内容

发明人发现，具有自主知识产权（专利申请号CN201210403666.2）的乙酰木聚糖酯酶AXE具有过水解活性，基于此，提出了本发明方案。因此，发明人要求将专利申请CN201210403666.2的内容一并并入本申请，包括申请中乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列SEQ ID NO：2；具有活性的同源三聚体、六聚体蛋白结构；以及基因工程菌大肠杆菌（Escherichia coli）BL21-pET-Cah的构建过程，以及构建获得的菌株。

本发明所要解决的技术问题在于，获得一种易于获取、高活性、高表达的酶，来进行过氧乙酸的酶法生产。

本发明的技术目的在于提供该酯酶在过水解反应中的应用。具体的，可用该酶催化过水解反应，更具体的，在过氧化氢存在情况下，可用该酶催化短链乙酸酯生成过氧乙酸。

具体的，本发明的技术方案包括：

具有SEQ ID NO:1 代表的氨基酸序列的乙酰木聚糖酯酶在过水解反应中的应用。

其中，本申请中SEQ ID NO:1 代表的氨基酸序列与中国专利申请CN201210403666.2中所述SEQ ID NO:2中代表的氨基酸序列一致。首先，发明人发现了该酶具有过水解活性，能够在过氧源存在时催化酰基底物生成过氧酸；其次，对于过水解反应应该理解为，在具有过氧源，如过氧化氢时，酶将酰基底物催化生成过氧酸。

在优选的反应中，该酶可以在过氧化氢存在条件下催化乙酰基底物生成过氧乙酸。