[发明专利]1,3-二羟基丙酮的重组基因工程菌的构建与应用

说明书

技术领域：本发明属于微生物发酵技术领域，涉及1,3-二羟基丙酮的重组基因工程菌的构建与应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮的合成方法主要有贵重金属催化氧化法和微生物法。重金属催化氧化甘油的合成法，由于无法克服催化选择性差的致命缺点，致使甘油转化率低于40%，DHA的产率低于25%。工业生产方法目前是利用微生物分批发酵。该法是在菌体生长到适当的时期，利用菌体产生的脱氢酶以甘油为底物进行脱氢反应，产生DHA。用于生产DHA的微生物主要是醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluoonobacter Oxydans)。菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，待菌种达到一定浓度后，接种到含有甘油的发酵培养基当中，经过60-80h的耗氧发酵后，再将发酵液一次放出，经分离纯化得到DHA。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌体生长到对数期时，并在产物DHA达到一定水平后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样就可以减少达到生产水平的生物量的时间，提高底物甘油的利用率，节约成本。分批发酵的特点是微生物所处的环境是不断变化的，发生杂菌污染，能够很容易终止操作。在发酵生产中，使用的菌种处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。但该法的主要问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解、失活，从而导致DHA的产率难以提高。本发明以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体pBluescript SK^-上，构建克隆载体pSK-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。构建的甘油脱氢合成1,3-二羟基丙酮工业工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到75%以上。

发明内容

     本发明的目的在于提供1,3-二羟基丙酮的重组基因工程菌的构建与应用。

     本发明通过下述方法实现的：

以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体pBluescript SK^-上，构建克隆载体pSK-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。构建的甘油脱氢合成1,3-二羟基丙酮工业工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。

质粒子及菌株：

克隆载体pBluescript SK^-，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。

限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。

产气气杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL,甘油5g,NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。

    富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10 g,琼脂粉10g,甘油3g,(NH₄)₂SO₄ 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.

    产品发酵培养基：

磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH₂PO₄.12H₂O 8.95g，KH₂PO₄ 1.5g,pH7.0        0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。