[发明专利]一种重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法

说明书

技术领域

    本发明涉及病毒纯化技术领域，更具体涉及到重组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析，属于生物医药领域。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，它是已知的生物分子材料中具有最高负电荷密度的分子，在生物医学领域应用广泛。但现有肝素的纯化方法难以工业化大规模生产。

发明内容

本发明的目的就是针对现有现有肝素的纯化方法难以工业化大规模生产之现状, 而提供一种有关重组单纯疱疹病毒的亲和层析方法，主要分为初步纯化和浓缩和高效液相色谱纯化两部分。

本发明包括如下步骤：

(I). 病毒上清在双羟色胺Tuffryn R聚砜胶囊过滤设备中滤除细胞碎片；

(II). 使用2L的聚醚砜膜盘式搅拌细胞超滤装置进行过滤浓缩，使用肝素亲和吸附缓冲液进行富集截留，浓缩液冻存于-80度冰箱；

(III). HR 5/5 层析柱填装肝素，再将浓缩后的样品解冻装入层析柱中；

(IV). pH 7.5、浓度为33mM的 NaCl在153cm/h下线性流速洗脱；

(V). 收集三个峰值洗脱液，冻存于-80度或液氮中。

步骤(I)中用到的是双 羟色胺TuffrynR聚砜膜0.45/0.2Am胶囊 过滤设备。

步骤(I)中超滤装置在工作中的外压应小于0.01mPa，速度为50mL/min 。

过滤器的有效面积为162平方厘米，截留分子量为30万。

步骤(II)1L病毒上清浓缩需要20倍恒定氮气压力和33.5cm/s的速度 。

步骤(II)中使用肝素亲和吸附缓冲液，其配方为150 mM NaCl in 20 mMTris-HCl buffer，pH 7.5。

步骤(III)中适合于亲和层析的层析柱填柱材料为tentacle-type FractogelR EMD 肝素(S)，Fractogel  EMD DEAE (M) ，和Fractogel EMD SO₃- (M) gels。

步骤(III)中层析柱填充完后要用20mM HEPES buffer, pH 7.5缓冲液在无盐条件下平衡。

步骤(III)中逐步洗脱所用NaCl的浓度和体积分别为150 mM，19.5 倍层析柱体积的NaCl，进行病毒获取和漂洗；350nM，13倍层析柱体积的NaCl进行病毒洗脱以及1200mM ，7.5 倍层析柱体积的NaCl进行最终高严格漂洗。

步骤(IV)中洗脱液NaCl的线性流量运行率为153cm/h。

      本发明的优点      :        采用肝素亲和层析就是利用它具有大量带负电荷的硫酸基团的分子特性，作为蛋白及病毒纯化中的亲和配体，选择性地结合病毒表面蛋白分子及其它分子，然后利用不同浓度的盐离子做梯度洗脱，以达到将病毒单独洗脱下来的目的。重组单纯疱疹病毒具有能和肝素亲和结合的性质，因此选择肝素亲和层析柱能方便快捷的纯化重组单纯疱疹病毒，并且能放大，为工业化大规模纯化重组单纯疱疹病毒奠定了坚实的基础。

附图说明

附图1：组单纯疱疹病毒的肝素亲和层析方法流程图。

附图2：三峰值收集病毒样品SDS-PAGE跑胶，然后考马斯亮蓝染色鉴定纯化效果图。

      具体实施方式    

以下内容，为详细的方案：

初步纯化和浓缩：

1．粗纯化的病毒上清在室温下使用双 羟色胺TuffrynR聚砜膜（0.45/0.2Am）胶囊 过滤设备（有效过滤面积500平方厘米）滤除 任何细胞和细胞碎片，在低背压（小于0.01mPa）条件下 50mL/min 1L或2L的规模进行超滤纯化。

2. 用无菌容器收集被纯化过的渗透液或进一步超滤后收集。

3. 使用2 - L的搅拌细胞超滤装置，直径150mm的Omega聚醚砜膜盘式过滤器（有效过滤面积 162平方厘米，截留分子量30万）进行浓缩；该膜要预先使用1L的Milli-Q水和40mL含10％FBS的DMEM介质清洗。

4. 1L的病毒上清浓缩需要20倍的恒定氮气压力（30磅）和极速（33.5 cm/s）。