[发明专利]L-赖氨酸基因工程生产菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种L-赖氨酸基因工程生产菌。

背景技术

L-赖氨酸作为人类和动物必需的氨基酸之一，在饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面被广泛使用，其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。目前，L-赖氨酸已是世界上第二大氨基酸品种。

L-赖氨酸的生产方法主要有四种，分别是提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法，前三种方法由于前体物成本高、工艺复杂等缺点，难以达到工业化生产的目的，发酵法制备L-赖氨酸是当前的主要生产方式。发酵法生产L-赖氨酸的微生物主要是谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌等也有使用。

利用谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌生产L-赖氨酸，多采用诱变方法获得高产菌株。1960年日本的木下祝郎、中山清等经紫外诱变获得了一株谷氨酸棒杆菌营养缺陷型菌株，开始了发酵法生产L-赖氨酸。Chaudhuri A(Chaudhuri A,Mishra AK,Nanda G.Lysine excretion by S-(2-aminoethyl)L-cysteine resistant mutants of Bacillus subtilis.Acta Microbiol Pol.1983；32(1):37-45.)等以枯草芽孢杆菌为出发菌株，经MNNG诱变处理后，利用AEC平板进行抗反馈抑制天冬氨酸激酶突变株的筛选，再利用紫外诱变，获得了产酸达21g/L的突变株。但是由于谷氨酸棒杆菌和短杆菌的最适生长温度是30度，生产效率在一定程度上制约了大规模发酵生产赖氨酸的需求，另外传统诱变方法由于其局限性，获取高产菌株的难度非常大。

随着基因工程技术的发展，大肠杆菌作为背景研究得最为清楚的模式微生物，具有生长速度快，遗传操作方法成熟的特点，适合作为宿主菌发酵生产赖氨酸。大肠杆菌合成赖氨酸通过天冬氨酸途径，从天冬氨酸开始，经过九步酶催化途径合成赖氨酸。天冬氨酸激酶(lysC编码)作为合成途径中的第一个关键酶，受该途径的末端产物赖氨酸反馈抑制，Brigitte Dauce-Le Reverend(Brigitte Dauce-Le Reverend,Michèle Boitel,Alain M.Deschamps,et al.Improvement of Escherichia coli strains overproducing lysine using recombinant DNA techniques.European J Appl Microbiol Biotechnol(1982)15:227-231.)等报道的高产赖氨酸的大肠杆菌TOC R21中的lysC发生了突变，天冬氨酸激酶活力较野生型提高了10倍。二氢吡啶二羧酸合酶(dapA编码)作为赖氨酸生物合成分支途径中的第一个酶，也是控制L-赖氨酸产量的最主要酶，在大肠杆菌中，dapA被赖氨酸抑制；而在黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌中，dapA不被末端产物赖氨酸抑制，Jong-Won Oh(Jong-Won Oh,Jin-Ho Lee Kap-Soo Noh,Hyune-Hwan Lee,et al.Improved L-lysine production by the amplification of the Corynebacterium glutamicum dapA gene encoding dihydrodipicolinate synthetase in E.coli.Biotechnology letters Vol 13No10,727-737(1991).)等将谷氨酸棒杆菌的dapA基因在大肠杆菌中进行过表达，提高了赖氨酸产量。日本味之素申请的专利US6040160中，报道了解除dapA、lysC反馈抑制作用的突变位点，增强了大肠杆菌L-赖氨酸合成途径相关基因的表达，过表达了来源于谷氨酸棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)，可直接催化四氢二吡啶二羧酸转化为二氨基庚二酸，提高了L-赖氨酸产量，糖酸转化率达到了30％；在EP0796912A1专利中，同时失活L-赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldcC，减少了L-赖氨酸降解，使赖氨酸产量增加了约2.3倍。

发明内容