[发明专利]在真核细胞中生产琥珀酸

权利要求书

1.包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述延胡索酸还原酶包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少40％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶来自Trypanosoma sp。

4.根据权利要求1到3中任一项的细胞，其中编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的所述核苷酸序列表达后，所述NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶在胞质溶胶中有活性。

5.根据权利要求1到4中任一项的细胞，其中所述细胞过量表达编码丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。

6.根据权利要求1到5中任一项的细胞，其还包含编码异源磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。

7.根据权利要求1到6中任一项的细胞，其还包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，在编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列表达后，所述苹果酸脱氢酶在胞质溶胶中有活性。

8.根据权利要求1到7中任一项的细胞，其还包含编码下述酶的核苷酸序列，在编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶的核苷酸序列表达后，所述酶在胞质溶胶中催化苹果酸转化成延胡索酸。

9.根据权利要求1到8中任一项的细胞，其还包含编码二羧酸转运蛋白的核苷酸序列。

10.根据权利要求1到9中任一项的细胞，其中至少一个编码醇脱氢酶的基因是无功能的。

11.根据权利要求1到10中任一项的细胞，其中至少一个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因是无功能的。

12.根据权利要求1到11中任一项的细胞，其中至少一个编码琥珀酸脱氢酶的基因是无功能的。

13.根据权利要求1到12中任一项的细胞，其为Aspergillus，优选地为Aspergillus niger。

14.根据权利要求1到12中任一项的细胞，其为Saccharomyces cerevisiae。

15.用于制备琥珀酸的方法，包括在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求1到14中任一项的真核细胞，其中，琥珀酸被制备。

16.根据权利要求15的方法，其中制备的琥珀酸用于生产药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。

17.包含能够通过根据权利要求16的方法获得的琥珀酸的发酵液。