[发明专利]在真核细胞中生产琥珀酸

说明书

本申请是申请号为200880117129.3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2008/065583的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及包含编码延胡索酸还原酶的核苷酸序列的重组真核细胞和使用所述重组真核细胞生产琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。

琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。

已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas sp.能生产琥珀酸。对这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。

WO2007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母，用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)对所述酵母加以转化。

尽管琥珀的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生物。

发明内容

本发明的一个目的是用于生产琥珀酸的替代性微生物。

根据本发明用包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞实现了这一目的，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。

惊讶地发现，与野生型真核细胞生产的琥珀酸量相比，根据本发明的重组真核细胞生产的琥珀酸的量有所提高。优选地，根据本发明的真核细胞与不包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1.2、优选至少1.5、优选至少2倍的琥珀酸。

在本文中使用时，根据本发明的重组真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽，或所述细胞经天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。

编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列可以是异源或同源的核苷酸序列，或者编码已通过突变、断裂或缺失被进一步遗传修饰的异源或同源的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。重组DNA技术是本领域公知的，如Sambrook和Russel(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press中。

用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。

关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。

根据本发明的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶使用NAD(H)作为辅助因子，其中大部分真核细胞包含FADH₂-依赖型延胡索酸还原酶，其中FADH₂是辅助因子。发现：真核细胞包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列是有利的，因为NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶为细胞提供了将NAD(H)氧化为NAD⁺并影响细胞中氧化还原平衡的其它选项。