[发明专利]通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法

权利要求书

1.通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：将SEQ ID NO.3所示核苷酸序列反向连入pBin19载体Sac I和Xba I酶切位点处，得RNAi载体pBin19::SlNZG；然后将pBin19::SlNZG载体转化农杆菌，获得农杆菌工程菌，再以农杆菌工程菌转染经过切割并预培养的番茄外植体，经共培养、诱导生芽及生根培养，最后筛选转基因番茄植株，得耐贮性番茄植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO.3所示核酸序列由以下方法制备：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，番茄cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经纯化后得SEQ ID NO.3所示核酸序列；所述PCR扩增的程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃后延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RNAi载体pBin19::SlNZG的构建方法为将SEQ ID NO.3所示序列用Kpn I和Xho I双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得RNAi中间载体pHANNIBAL::SlNZG(i)，然后用Sac I和Spe I双酶切中间载体pHANNIBAL::SlNZG(i)，再与经Sac I和Xba I双酶切的pBin19载体连接，得RNAi载体pBIN19::SlNZG。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：制备农杆菌工程菌的方法是将农杆菌单菌落、含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒pBin19::SlNZG的大肠杆菌DH5α单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2％(w/w)琼脂的pH7.2的YEB固体培养基中央直径为1cm的圆圈中，28±2℃黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团，在含有质量分数为1.2％的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的pH7.2的YEB固体培养基中划线，28±2℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的pH7.2的YEB液体培养基，在28±2℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD₆₀₀为1.8-2.0，提取重组质粒，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，阳性重组子即为农杆菌工程菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预培养番茄外植体的步骤如下：

a.用体积分数为75％的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；再用灭菌的饱和Na₃PO₄浸泡种子20min，然后用无菌水冲洗3次；接着用1％(V/V)的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；再用无菌水浸泡种子4h后将番茄种子播种在MS固体培养基上，然后于28℃光照16h和18℃黑暗8h的培养箱中培养，且光照强度为1000-2000lx，所述MS固体培养基为蔗糖终质量浓度3％、琼脂终质量浓度0.6-0.8％的pH5.9的MS培养基；

b.待种子萌发长出子叶得番茄外植体，然后将番茄外植体的子叶切下，在MS液体培养基中浸泡1h，滤纸吸干残留液体培养基并放置在质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.9的MS固体培养基中，28℃光照16h和18℃黑暗预培养1d得预培养番茄外植体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染为将预培养番茄外植体置于农杆菌工程菌中浸染15分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养为将转染后的番茄外植体于质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L吲哚乙酸、1.75mg/L玉米素、pH为5.9的MS固体培养基中，在28±2℃黑暗条件下共培养48小时。