[发明专利]通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法。

背景技术

番茄是一种深受人们所喜爱的世界性蔬菜，而番茄营养丰富，具特殊风味。具有减肥瘦身、消除疲劳、增进食欲、提高对蛋白质的消化、减少胃胀食积等功效。在自然界中，果实软化有利于种子的传播和物种的稳定；而在农业和商业生产中，果实软化有利于改善口感和营养价值。但是，果实过度软化后易发生腐烂、变质，造成巨大的经济损失。在自然条件下，番茄未成熟果实可以室温保持2个月左右，而成熟的红果实只能保持30天左右。在番茄成熟到运输转卖以及贮藏过程中，会有大量的番茄腐烂浪费。而近年来，随着基因工程的迅速发展和RNAi技术体系的日益完善，基因工程技术在提高番茄耐贮性性方面显示了极大的潜力。目前，基因工程技术已广泛的用于番茄品种的改良和育种中。利用基因工程技术快速获得稳定遗传的番茄新品种必将是当前和未来的发展趋势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法，该方法简单，能够获得耐贮番茄品种。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

通过沉默番茄基因SlNZG培育耐贮番茄植株的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.3所示核苷酸序列反向连入pBin19载体Sac I和Xba I酶切位点处，得RNAi载体pBin19::SlNZG；然后将pBin19::SlNZG载体转化农杆菌，获得农杆菌工程菌，再以农杆菌工程菌转染经过切割并预培养的番茄外植体，经共培养、诱导生芽及生根培养，最后筛选转基因番茄植株，得耐贮性番茄植株。

优选的，所述SEQ ID NO.3所示核酸序列由以下方法制备：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，番茄cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经纯化后得SEQ ID NO.3所示核酸序列；所述PCR扩增的程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃后延伸10min。

优选的，所述RNAi载体pBin19::SlNZG的构建方法为将SEQ ID NO.3用Kpn I和Xho I双酶切，再与经同样双酶切的pHANNIBAL载体连接，获得RNAi中间载体pHANNIBAL::SlNZG(i)，然后用Sac I和Spe I双酶切中间载体pHANNIBAL::SlNZG(i)，再与经Sac I和Xba I双酶切的pBin19载体连接，得RNAi载体pBIN19::SlNZG。

优选的，制备农杆菌工程菌的方法是将农杆菌单菌落、含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌单菌落和含有重组质粒pBin19::SlNZG的大肠杆菌DH5α单菌落依次重叠均匀涂在含有1.2％(w/w)琼脂的pH7.2的YEB固体培养基中央直径为1cm的圆圈中，28±2℃黑暗条件下倒置共培养24小时至长出菌团，用接种环挑取菌团，在含有质量分数为1.2％的琼脂、50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的pH7.2的YEB固体培养基中划线，28±2℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天至长出单菌落，挑取3-4个单菌落，用含有50mg/L利福平、500mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的pH7.2的YEB液体培养基，在28±2℃、黑暗、200rpm条件下摇床培养1.5天至菌液均匀且OD₆₀₀为1.8-2.0，提取重组质粒，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，阳性重组子即为农杆菌工程菌。

优选的，预培养番茄外植体的步骤如下：

a.用体积分数为75％的酒精浸泡番茄种子2min，无菌水冲洗3次；再用灭菌的饱和Na₃PO₄浸泡种子20min，然后用无菌水冲洗3次；接着用1％(V/V)的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗7次；再用无菌水浸泡种子4h后将番茄种子播种在MS固体培养基上，然后于28℃光照16h和18℃黑暗8h的培养箱中培养，且光照强度为1000-2000lx，所述MS固体培养基为蔗糖终质量浓度3％、琼脂终质量浓度0.6-0.8％的pH5.9的MS培养基；