[发明专利]可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，该菌株诱导表达AbrB蛋白，该菌株可通过调节发酵液中乳糖或者异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度对芽孢的生成进行调控；

该菌株含有可诱导表达点突变的AbrB蛋白的重组质粒pDG148-AbrB-mutant，具体为将第42位氨基酸天冬氨酸突变为丙氨酸的AbrB-mutant，所述AbrB-mutant序列为SEQ IDNO.2。

2.一种可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)以枯草芽胞杆菌基因组为模板，使用引物AbrB-1和AbrB-2，利用PCR方法扩增获得AbrB基因序列AbrB，所述AbrB基因序列为SEQ ID NO.1，其中引物AbrB-1和AbrB-2分别为：

AbrB-1：5’-CCCAAGCTTATGTTTATGAAATCTACTGGTATTGTACG-3’；

AbrB-2：5’-ACGCGTCGACTTATTTAAGGTTTTGAAGCTGGTTT-3’；

以PCR方法扩增获得的AbrB基因序列为模版，使用引物AbrB-1、AbrB-2、AbrB-3和AbrB-4，利用PCR方法扩增得到AbrB点突变序列AbrB-mutant，所述AbrB-mutant序列为SEQ IDNO.2，其中引物AbrB-1、AbrB-2、AbrB-3和AbrB-4分别为：

AbrB-1：5’-CCCAAGCTTATGTTTATGAAATCTACTGGTATTGTACG-3’；

AbrB-2：5’-ACGCGTCGACTTATTTAAGGTTTTGAAGCTGGTTT-3’；

AbrB-3：5’-ATTTATGTTGATGCTGAAAAAATC-3’；

AbrB-4：5’-GGATGATTTTTTCAGCATCAAC-3’；

(2)利用pDG148-stu质粒，经限制性内切酶Hind III和Sal I进行双酶切处理后和AbrB或AbrB-mutant基因序列连接，构建AbrB重组表达质粒pDG148-AbrB或点突变的AbrB-mutant重组表达质粒pDG148-AbrB-mutant；

(3)将质粒pDG148-AbrB或pDG148-AbrB-mutant转入枯草芽孢杆菌中，获得可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(1)中枯草芽胞杆菌基因组为Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis CGMCC NO.2270基因组DNA。

4.一种如权利要求1所述的可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用，其特征在于该菌株用于发酵过程中调控芽孢的生成。

5.如权利要求4所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用，其特征在于所述发酵过程中调控芽孢的生成包括枯草芽孢杆菌的培养步骤和高浓度枯草芽孢杆菌菌体或枯草芽孢杆菌芽孢的获得步骤。

6.如权利要求5所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用，其特征在于所述枯草芽孢杆菌的培养步骤为：按照体积比1％-7％的接种量向发酵培养基中接种含有重组质粒的枯草芽孢杆菌基因工程菌，在37℃下培养。

7.如权利要求5所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用，其特征在于所述高浓度枯草芽孢杆菌菌体的获得步骤为：在发酵初期添加乳糖或者IPTG诱导AbrB或经点突变的AbrB-mutant蛋白表达，从而抑制芽孢生成，获得高浓度枯草芽孢杆菌菌体的发酵液。

8.如权利要求5所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用，其特征在于，所述高浓度枯草芽孢杆菌芽孢的获得步骤为：在发酵过程中前期控制发酵液中乳糖浓度为1-5g/L，诱导AbrB或经点突变的AbrB-mutant蛋白的表达，抑制芽孢生成，获得高浓度枯草芽孢杆菌菌体，在发酵后期停止添加乳糖，待发酵液中乳糖消耗完全，重组蛋白停止表达，同时调节发酵温度为40-45℃，促进枯草芽孢杆菌生成芽孢，获得高芽孢浓度的发酵液。