[发明专利]可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，利用枯草芽孢杆菌芽孢形成关键调控蛋白AbrB基因和大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭质粒pDG148‑stu构建可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌，并将其应用在枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵过程控制芽孢生成中。本发明的有益效果是：利用本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌进行发酵，可通过调节乳糖或IPTG浓度来调控枯草芽孢杆菌芽孢的生成，从而获得高浓度枯草芽孢杆菌菌体的发酵液，或者获得高芽孢浓度的发酵液，利用该方法可以提高生产效率，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，可用于枯草芽孢杆菌发酵过程中芽孢生成的调控，属于生物技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiis)是一种好氧、产芽孢的杆状细菌。该菌具有生长迅速、营养需求简单、能分泌表达多种酶和生物活性物质等特性，在工业、农业、医药、食品、环境保护等领域应用广泛。

枯草芽孢杆菌是工业酶生产应用最广泛的菌种之一，例如，利用枯草芽孢杆菌表达的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等被广泛应用于生物化工、食品、医药等领域。枯草芽孢杆菌还可被制成微生物菌剂，用于改善人体和动物肠道功能、疾病防治和促进动物生长。枯草芽孢杆菌还具有抑制植物病害的功能，可用于植物生防菌剂的生产。

枯草芽孢杆菌在发酵过程中有形成芽孢的特性，利用枯草芽孢杆菌进行发酵生产，针对目标产物不同，需要调节发酵条件，以期获得较高的菌体浓度或者芽孢浓度。枯草芽孢杆菌芽孢的形成受多个基因的调控，在菌体生长时，这些基因一般不表达，它们可能被一个阻遏体系所调控，一旦消除阻遏因素，芽孢即可生成，其中一个关键调节蛋白AbrB，由基因AbrB编码。

申请号为201110051406.9、发明名称为“一种高芽孢率的枯草芽孢杆菌发酵方法”的中国专利和申请号为201210544003.2、发明名称为“一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法”的中国专利均提供了获得高芽孢率的枯草芽孢杆菌的培养方法，枯草芽孢杆菌芽孢率显著提高，但是只涉及培养基及培养条件的优化，通过调节发酵参数以获得较高浓度的芽孢发酵液。目前尚未发现可调控枯草芽孢杆菌关键转录因子AbrB蛋白表达的的基因工程枯草芽孢杆菌，以及利用该基因工程菌进行高浓度芽孢发酵液的发酵方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，其优选的AbrB基因是将原始AbrB(序列表SEQ ID NO.1中所示序列)的第42位氨基酸(天冬氨酸)突变为丙氨酸，点突变的序列为AbrB-mutant(序列表SEQ ID NO.2中所示序列)。

本发明的另一目的是提供利用本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中控制芽孢生成的应用，从而获得高浓度枯草芽孢杆菌菌体或者高浓度枯草芽孢杆菌芽孢。

将调控枯草芽孢杆菌芽孢形成关键蛋白AbrB的基因AbrB或经点突变的AbrB-mutant插入到质粒pDG148-stu上，构建重组质粒，将该质粒转入到枯草芽孢杆菌中，即成本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌。利用本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌进行发酵，发酵过程中可通过控制乳糖或者IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度来调控枯草芽孢杆菌芽孢的生成，从而获得高浓度枯草芽孢杆菌菌体或者高浓度枯草芽孢杆菌芽孢。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于该菌株通过诱导表达AbrB蛋白调控芽孢的生成。

该菌株可通过调节发酵液中乳糖或者IPTG浓度对芽孢的生成进行调控。