[发明专利]一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法。

(二)背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为常见院感病原菌，是临床医院感染重点监测的病原菌之一。随着碳青霉烯类抗生素的大范围使用，多药耐药株肺炎克雷伯菌不断出现。由肺炎克雷伯菌感染导致巴西大规模流行的“超级细菌”事件使全球的目光又聚焦到了“多重抗生素耐药”和“肺炎克雷伯菌”上。

据报道，一些肠杆科属细菌体内也发现携带肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶，如大肠埃希菌、沙门菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、沙雷菌等，使得利用临床抗生素治疗细菌感染性疾病失败或者造成治病疗程延缓。肺炎克雷伯菌产生耐药性的机理主要是菌体产生质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)，进而导致菌体外膜孔蛋白丢失、抗菌药物主动外排、生物被膜形成、基因变异等，因此针对于抑制上述两种酶活性的抗生素治疗是解决肺炎克雷伯菌耐药性的关键。碳青霉烯类抗生素是目前临床使用的抗菌活性最强、抗菌谱最广的一类抗生素，尤其对产超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶的菌株治疗效果极佳，因此在临床上被广泛使用。随着该类抗生素使用频率的不断提高，在世界范围内不断出现了产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)。碳青霉烯酶是一种由质粒编码并能够被克拉维酸抑制的酶类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，因此该类菌株的出现是导致临床抗生素治疗失败的主要原因。肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶是近年来发现的新型碳青霉烯酶类，属于Bush分类的2f组，Ambler分类的A类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等临床常用的抗生素。肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶基因位于可转移的质粒上，可依靠质粒、整合子、插入序列的基因元件进行传播，这也是多药耐药菌株易于传播的重要原因。

目前有报道采用多重荧光定量PCR技术结合酶切的方法针对肺炎克雷伯菌KPC-2和KPC-3型碳青霉烯酶进行分型。最新的文献报道采用多重荧光定量PCR结合分子信标技术对11种类型的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因进行区分。该11种碳青霉烯酶基因型是由5个不同的基因多态性位点构成。

对于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因分型及新基因筛查相关工作开展较少，国内并无该方面研究，而且对于每种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因亚型的生物学功能尚不清楚。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型分类方法，该方法对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)基因KPC 1-15共14种亚型进行分型，该方法涉及一对大片段扩增引物，六条SNaPshot检测用引物，扩增结果使用毛细管测序基因分析仪检测，操作方便。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型检测方法，所述方法为：以待测菌株基因为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR扩增反应，然后以扩增产物为模板，在引物3-引物8的混合引物作用下进行SNaPshot PCR反应，对SNaPshot PCR产物进行测序；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位和814位均为C碱基(即胞嘧啶)，272位为T碱基(即胸腺嘧啶)，502位为G碱基(即鸟嘌呤)，716位为A碱基(即腺嘌呤)，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-1或KPC-2；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位为C碱基，272位和814位为T碱基，502位为G碱基，716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-3；

若SNaPshot PCR产物在147位、716位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-4；

若SNaPshot PCR产物在147位和814位为C碱基，在308位和502位为G碱基，在272位为T碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-5；

若SNaPshot PCR产物在147位、308位、716位和814位为C碱基，在272位为T碱基，在502位为G碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-6；

若SNaPshot PCR产物在147位、272位和814位为T碱基，在308位为C碱基，在502位为G碱基，在716位为A碱基，则待测菌株的碳青霉烯酶基因型为KPC-7；