[发明专利]定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品检测领域，具体地说，涉及一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法。

背景技术

目前，我国禽用禽流感病毒灭活抗原的检测方法主要有免疫攻毒动物法、血凝和血凝抑制试验。以上方法人工成本高、效率低、检测步骤繁琐，准确度难以保证，主要表现在以下几个方面：(1)血清学方法，即血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，该试验必需新鲜鸡红细胞，而结果判读受细胞质量、操作者主观性影响较大；(2)免疫攻毒法，该试验人工成本高、耗时长，动物试验本身受干扰因素多。禽用禽流感病毒灭活疫苗质量控制对于我国动物禽流感的防控具有举足轻重的作用，采用单向免疫扩散(SRID)定性、定量检测禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份的方法，利用抗原抗体表位特异性反应的原理，只要存在免疫原性表位即可检测，不存在误检、漏检问题；该方法耗时短，批量检测样本多，疫苗的质量能得到批量控制。

单向免疫扩散(SRID)分析禽用禽流感病毒抗原有效成分是基于有活性的抗原成分血凝素(HA)含量，而不能检测已经失活的HA，因此，SRID检测抗原有效成分是经典而可靠的方法；而现有的SRID定性定量分析病毒抗原试验方法反应缓慢、具有易变性和有限检测范围、不能检测成品疫苗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种改良SRID方法定性定量分析禽用禽流感病毒灭活抗原有效成份的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

一种定性定量分析禽用禽流感病毒抗原有效成分的方法，包括以下步骤：

(1)制备含PEG-6000的免疫琼脂板；

(2)样品的处理(成品疫苗特别处理)；

(3)加样扩散；

(4)漂洗、干燥、染色、脱色；

(5)测量，绘制标准抗原回归曲线，计算浓度。

进一步地，所述免疫琼脂板中PEG-6000的浓度为2％-3％(百分号“％”是指100mL溶液中含有溶质的克数)。

进一步地，所述步骤(1)中的免疫琼脂板为25.4×76.2mm(1＂×3＂)，厚度为1mm-1.2mm；10mL琼脂糖溶液冷却至56℃左右，加入200μL标准抗体；3mm直径孔，孔间距5mm。

进一步地，步骤(2)中所述的样品包括标准抗原和待测样品；所述标准抗原为标准禽流感灭活病毒抗原，经稀释处理形成浓度梯度；所述待测样品为禽用禽流感成品疫苗或禽流感灭活病毒抗原。

当待测样品为禽用禽流感成品疫苗，须经特别处理：将苯酚按1/5比例加入成品疫苗中，充分震荡混匀后，10000rpm离心3分钟，取上清水相4℃保存备用待检。

当灭活病毒抗原浓度低于4.5μg/μL或者HA效价浓度log2低于7时需浓缩处理，具体浓缩方法如下：

(1)超滤法：将待检样品5000rpm离心10min；取上清，加入超滤离心管(100KD，再生纤维膜)中，4000rpm离心至中间套管内至合适体积为止。

或(2)超速离心法：将待检样品用5000rpm离心10min；取上清，加入超速离心管内，4℃25000rpm(82700g)离心2h，然后加入适量PBS稀释，4℃溶解2h或过夜。

进一步地，所述步骤(3)具体为：将梯度稀释的标准抗原、待检样品和阴性对照在免疫琼脂板中加样；所述梯度稀释的标准抗原、待检样品须在同一个反应板上，每个加样孔加样10μL。扩散条件为：室温(20-25℃)反应12h-16h。

进一步地，步骤(4)中的所述漂洗为：将免疫琼脂板放入PBS中室温浸泡2h，以去除血红蛋白而不改变扩散圈的大小和强度，期间换PBS缓冲液3-5次。

步骤(4)中的所述干燥为：从PBS中取出拨片上的免疫琼脂板，用粗滤纸吸取免疫琼脂板水分30min以上，放入56℃干燥30min左右至滤纸完全干燥。

步骤(4)中的所述染色为：用0.5％考马斯亮蓝溶液染色干燥的免疫琼脂板4-6min(5min左右)；脱色方法为用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。

步骤(4)中的所述脱色为：用脱色液脱色15min以上直至沉淀圈外蓝色脱掉，期间适当换脱色液。