[发明专利]尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途

权利要求书

1.一种尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，包括用于分别检测尼帕病毒M基因和猪繁殖与呼吸综合症病毒NSP2基因的二对特异性引物、二条特异性探针和二个阳性对照，扩增目标长度分别为79bp和95bp，引物和探针序列为：

尼帕病毒

上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’      SEQ ID NO.1

下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’      SEQ ID NO.2

探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB        SEQ ID NO.3

阳性对照：GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC；

SEQ ID NO.4

猪繁殖与呼吸综合征病毒

上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’      SEQ ID NO.9

下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’     SEQ ID NO.10

探针：PRRSV-NSP2-P:5’-VIC-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’         SEQ ID NO.11

阳性对照：GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC

SEQ ID NO.12。

2.如利要求1所述的尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择尼帕病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：

GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC；

(2)选择猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：

GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC；

(3)设计4条引物，以之PCR扩增和制备尼帕病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：

NIPHA-M-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3

NIPHA-M-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3

NIPHA-M-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’

NIPHA-M-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’

(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：

PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’

PRRSV-NSP2-R1:5’-CCCCGCCTCCAGGATGCCCATGTTCTGCGATGGTGCTAGGGGGAAAGCCTCATATTCC-3’

PRRSV-NSP2-F2:5’-GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTA-3’

PRRSV-NSP2-R2:5’-GAGATTTCACTCAGGACTTCCTCAGCTTCTTGCCCCCCCGCCTCCAGGATGCCCATG-3’

(5)根据尼帕病毒M基因阳性对照序列和猪繁殖与呼吸综合症病毒NSP2阳性对照序列设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：

尼帕病毒

上游引物：NIPHA-M-F:5’-GCTCAACAGATTGACCTGGAAC-3’      SEQ ID NO.1

下游引物：NIPHA-M-R：5’-AACAGAAGGCTGCAACACAGC-3’      SEQ ID NO.2

探针：NIPHA-M-P:5’-FAM-CTCGGCTGATCTCACA-3’-MGB        SEQ ID NO.3

猪繁殖与呼吸综合征病毒

上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’    SEQ ID NO.9

下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’   SEQ ID NO.10

探针：PRRSV-NSP2-P:5’-VIC-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’       SEQ ID NO.11

(6)检测尼帕病毒M基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪繁殖与呼吸综合症病毒NSP2基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；

(7)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定二重荧光RT-PCR最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。