[发明专利]尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途。

背景技术

尼帕病毒(Nipah Virus，NiV)是1999年确定的一种严重危害家猪和人类的新病毒，能够引起人和猪的神经系统和呼吸系统疾病。猪呼吸与繁殖综合征是由猪呼吸与繁殖综合征病毒引起猪的一种以断奶前仔猪高死亡率、育成猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍为主要症状的高度接触性传染病。由于猪的尼帕病和猪呼吸与繁殖综合征在临床上有相似表现，仅凭临床症状不易区分，因此对临床疑似发病猪进行尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的鉴别检测，不仅能够为及早发现和控制这两种动物疫病提供病原学依据，而且还能够及时防控人类尼帕病的爆发和流行。多重荧光定RT-PCR方法可同时检测多种病原核酸，具有一次RT-PCR反应就能简便、快速地鉴别和检测多种病原的优点。目前检测单一尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的荧光RT-PCR方法和公开专利均有报道，而能够同时检测尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与应用，还罕见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，具体涉及一种分别以尼帕病毒M和猪繁殖与呼吸综合症病毒NSP2基因为扩增靶序列而研制的检测试剂，该检测试剂包括二对引物、二条标记探针和二个阳性对照。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是通过以下步骤实现的：一种尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂，包括用于分别检测尼帕病毒M基因和猪繁殖与呼吸综合症病毒NSP2基因的二对特异性引物、二条特异性探针和二个阳性对照，扩增目标长度分别为79bp和93bp，引物和探针序列为：

尼帕病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒

上述的尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择尼帕病毒M基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：

GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCCAAGAGAGTTCATGATCTATGATGATGTCTTC；

(2)选择猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：

GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC；

(3)设计4条引物，以之PCR扩增和制备尼帕病毒M基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8如下：

NIPHA-M-F1:5’-CCTGGAACAACAGTTGTGAGATCAGCCGAGTAGCAGCTGTGTTGCAGCCTTCTGTTCC-3

NIPHA-M-R1:5’-GGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTGCTACTCGGCTGATCTCACAACTGTTGTTCCAGG-3

NIPHA-M-F2:5’-GATGGACATCAATCCTTGGCTCAACAGATTGACCTGGAACAACAGTTGTGAGATC-3’

NIPHA-M-R2:5’-GAAGACATCATCATAGATCATGAACTCTCTTGGAACAGAAGGCTGCAACACAGCTG-3’

(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：

PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’