[发明专利]一种检测猪早孕因子胶体金检测试纸卡及其制备方法

权利要求书

1.猪早孕因子胶体金检测试纸卡，其特征在于：

所述的猪早孕因子胶体金检测试纸卡由胶体金试纸条和扣板式卡槽组成；扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区；胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成；

所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫；

所述NC膜的中部有一条含有猪早孕因子多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线；

胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的样品垫；

所述载样垫中金标单克隆抗体为鼠源猪早孕因子单克隆抗体；

所述NC膜中猪早孕因子抗体为兔抗猪早孕因子多克隆抗体；所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。

2.如权利要求1所述的猪早孕因子胶体金检测试纸卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)制备NC膜

兔抗猪早孕因子多克隆抗体的制备：采用原核表达并纯化的猪早孕因子蛋白作为免疫原，提取IgG抗体，制备兔抗猪早孕因子多克隆抗体；

检测线的制备：采用三维喷膜仪，调整喷液量为45～50dots/mL/cm，用包被缓冲液稀释兔抗猪早孕因子多克隆抗体，浓度为45～50μg/mL，在NC膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.40～0.45μL滤膜过滤的0.05～0.07M、pH9.6的CBS缓冲液；

质控线的制备：采用三维喷膜仪，调整喷液量为45～48dots/ml/cm，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体，浓度为1mg/ml，在NC膜上与检测线平行的位置划线，与检测线间隔4～5mm，即为质控线；所述的包被缓冲液为经过0.40～0.45μl滤膜过滤的0.03M、pH9.4的CBS缓冲液；

NC膜组装制备：晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜；用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5％BSA、2.5～3.0％脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后用0.45～0.48ul滤膜过滤得到的封闭工作液。

(2)制备涂覆金标单克隆抗体垫

用20mM含质量百分比为1.5％BSA、0.1％NaN₃和3％四硼酸钠稀释缓冲液将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml；裁取规格为300×7mm的玻璃纤维棉，将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪，以5μL/cm的速度(大约20ng/条)，均匀喷洒于玻璃纤维棉上，56℃干燥1h，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。

(3)组装猪早孕因子胶体金检测试纸卡

将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维膜和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为猪早孕因子胶体金检测试纸卡。

(4)猪早孕因子胶体金检测试纸卡使用及判定

猪早孕因子胶体金检测试纸卡在诊断猪早期妊娠中应用，分离血清，将所得的血清滴加在本试纸卡的样品垫中，样品顺吸水垫上移，当遇到金标单克隆抗体时猪早孕因子与金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体结合，抗原-抗体-金复合物向检测线和质控线移动，猪早孕因子与检测线上的兔抗猪早孕因子多克隆抗体结合，形成一条红色的检测线，阴性血清中无猪早孕因子不能结合金标鼠抗猪早孕因子单克隆抗体，所以无肉眼可见的检测线出现；质控线永远呈红色，如果无色的，表示试纸条失效。

3.如权利要求2所述的猪早孕因子胶体金检测试纸卡的制备方法，其特征在于：步骤(1)中检测线和质控线的线宽为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6～7mm。