[发明专利]一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋农业中贝类多倍体检测技术领域，具体涉及一种利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法。

背景技术

动物的循环系统有开管式循环和闭管式循环2种，开管式循环的血液经心脏、大血管流出后，进入器官间或组织间隙，血液与其细胞直接接触。闭管式循环的血液始终在血管中流动，血液与其细胞不直接接触(徐俊延，董秀丽，1998)。对于软体动物而言，其体腔演化为真假体腔并存形式，真体腔退化为痕迹，残留在围心腔以及生殖器官和排泄器官的官腔内，而假体腔广泛存在于器官组织之间的间隙中，其中充满血液，成为血窦，是循环系统的一部分。由于血窦的存在，大多数软体动物循环系统为开管式循环，这种循环与其缓慢的生活方式相适应，但头足类为闭管式循环，即动静脉之间有血管相连，与其敏捷快速运动相适应。大多数软体动物血液是无色的，仅有少量为蓝色，内含血青素(王如才等，2008)。

牡蛎属于软体动物门瓣鳃纲牡蛎科动物，循环系统为开管式循环，组织间隙间充满了体腔液，体腔液中含有大量的血淋巴细胞。由于牡蛎血淋巴为无色透明液体，为此很难辨认出这种透明液体就是血淋巴。过去牡蛎多倍体的倍性检测过程中，学者们均采用鳃、外套膜、闭壳肌等组织作为实验材料，利用流式细胞仪进行DNA含量测定，从而判断倍性组成。这种取样操作杀死样品本身，不利于该样品以后的应用。因此，开发一种操作简单、无损伤的牡蛎倍性检测方法将具有重要的科研和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了简化利用流式细胞仪检测DNA含量的步骤，克服当前检测倍性取样时会杀死牡蛎样本的缺陷，而提供一种操作简单、检测准确率达100％，且对检测的牡蛎样品无损伤的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法。

本发明的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，其特征在于，其是以牡蛎样品体腔液中淋巴细胞作为检测材料，检测其DNA含量，然后再判定牡蛎样品的倍性组成。

优选，所述的利用牡蛎体腔液中淋巴细胞检测牡蛎倍性的方法，具体步骤为：

a、淋巴液抽取：将牡蛎样品放置于海水中，当其自然张开双壳时，利用注射器插入体腔中，取体腔液；

b、离心重悬：将体腔液离心后去除上清液，加入海水悬浮，过滤，得淋巴细胞；

c、细胞核染色：将淋巴细胞用DAPI染液染色；

d、染色后的样品混合均匀后检测其DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。

所述的步骤a的牡蛎样品优选壳高为30mm以上的牡蛎，个体太小，不容易获得体腔液。

所述的步骤b的离心，其转速优选为800-1200r/min，转速过大，会导致淋巴细胞破裂，转速过低，淋巴细胞无法沉淀至管底。

所述的步骤b的过滤优选采用孔径为50-100μm滤网过滤。

所述的步骤c的将淋巴细胞用DAPI染液染色优选是将淋巴细胞放于DAPI染液(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，4',6-diamidino-2-phenylindole，其配制方法是：将1mg DAPI干粉和25.9g柠檬酸钠溶解于500ml去离子水中)中，染色2～3min。染色后的样品可以直接用于DNA含量检测，也可以放置于-20℃冰箱中长期保存，之后进行DNA含量测定。

所述的步骤d的染色后的样品混合均匀后检测DNA含量，优选是将染色后的样品混合均匀后直接通过流式细胞仪在波长488nm通道下检测DNA含量，确定牡蛎样品的倍性组成。

本发明不同于以往牡蛎倍性测定操作，此前的牡蛎DNA含量检测，均需采用鳃、外套膜、闭壳肌等组织作为样品，不仅仅需要制备单细胞悬液，而且还要将样本杀死，导致样品本身的后续工作很难开展。本发明结合牡蛎具有开管式循环，体腔液中含有大量淋巴细胞的特性，仅仅采用体腔液中的单细胞淋巴作为检测样品，不仅仅省略单细胞悬液制备步骤，而且检测准确率为100％，并可以保证牡蛎样品本身100％存活，不受到任何伤害，这为牡蛎倍性活体检测奠定了理论与实践应用基础。本发明具有快速、简便、实用性强等优点。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中所用DAPI染液，其配制方法为：将1mg DAPI干粉和25.9g柠檬酸钠溶解于500ml去离子水混合均匀而成。

实施例1