[发明专利]一种用于多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质检测领域，具体涉及一种基于能量转移的可用于活细胞内多种蛋白酶活性长时间实时并行检测的纳米探针。

背景技术

蛋白质的发展史中，蛋白酶的研究占极重要的地位，它来源丰富，容易提纯，分子量小，功能较简单。细胞生命周期的各个阶段都与蛋白酶紧密相关，例如在细胞的融合与分化以及大分子的装配等过程中，都有相应专一的蛋白酶参与，它们起着很重要的生物调控作用。目前，对蛋白质的一级结构至高级结构以及酶的作用机制的研究一直处于生物医学领域的前沿。

2005年，美国莱斯大学的Emmanue等开发了一种基于量子点和金颗粒的发光探针，能够用来测定蛋白水解酶的活性，遗憾的是，该检测并不能应用于活细胞的检测。(Chang E,Miller J S,Sun J T,et al.Protease-activated quantum dot probes.Biochemical and Biophysical Research Communications.2005,334:1317-1321.)2010年，Youngseon等人通过量子点和有机熄灭剂构成的荧光探针，检测了转染了HIV-1蛋白酶的活性，但该探针只检测了一种酶的活性，没有实现多种酶的并行检测。(Choi Y,Lee J,Kim K,et al.Fluorogenic assay and live cell imaging of HIV-1protease activity using acid-stable quantum dot-peptide complex.Chemical communications.2010,46:9146-9148.)2012年，伯克利Stuart B.Lowe等在ACS Nano报道，在细胞外用基于能量转移的探针能同时检测serine protease(丝氨酸蛋白酶)、tyrosine kinase(酪氨酸激酶)两种不同类型酶的活性，然而该检测过程是在细胞外进行的。(Lowe S B,Dick J A G,Cohen B E,et al.Multiplex Sensing of Protease and Kinase Enzyme Activity via Orthogonal Coupling of Quantum Dot Peptide Conjugates.ACS Nano.2012,6:851-857.)

在活系统中，很多蛋白酶被表达为非活性的前体蛋白(酶原)，然后在控制下被蛋白水解裂解之后被激活。对于蛋白水解活性的其他控制来自于内源性抑制剂，所述内源性抑制剂与蛋白水解酶的催化活性形式结合并使之灭活。由于存在这种严格的控制，因此在细胞或生理学时间中研究蛋白酶功能时需要检测蛋白酶活性而不只是检测蛋白酶的表达。目前蛋白酶的检测方法一般都需裂解细胞，将蛋白酶分离然后检测，不能够实时动态反映酶的变化；而能够检测单细胞内部酶的活性的现有方法并不能实现并行检测。同时目前基于荧光检测酶活性的成熟方法，采用荧光蛋白或有机染料，都面临荧光漂白的问题。荧光强度自身漂白很快，一方面会给检测结果带来很大误差，同时也不能够长时间检测。

现阶段蛋白酶的活性检测主要集中在单一种类酶的活性检测，如研究细胞凋亡主要集中在caspase家族上，而越来越多的文献报道，细胞中尤其是溶酶体中的其它蛋白酶也参与了细胞的凋亡过程，例如胰凝乳蛋白酶chymotrypsin B(CtrB)。(Zhao K,Zhao X,Tu Y,et al.Lysosomal chymotrypsin B potentiates apoptosis via cleavage of Bid.Cellular and Molecular Life Sciences.2010,67:2665-2678.)同时每种细胞中的蛋白酶的含量及活化时间也因细胞种类的不同而有所差异，即使是同一种细胞，不同细胞间的蛋白酶活性也不同。同一个细胞，在生命周期各个阶段不同的蛋白酶参与新陈代谢的情况也有差异，所以需要基于活细胞的多种蛋白酶并行检测手段。

如果需要更加整体、准确地了解蛋白酶在细胞内部的表达、含量变化、物理空间位置变化，单独分析一种蛋白酶往往是不够的。细胞作为一个生命体，其中各种物质往往是同时发生作用，相互影响，相互调节。如caspase家族的蛋白，通常不是单独发生作用，而它们是何时发生作用的，又是以怎样的顺序发生作用的，这些问题的答案都是目前检测方法无法得到的。有些酶的活性只在细胞生理周期的某个阶段表现出来，而目前的检测方法也无法监测酶的这种瞬态活性变化。