[发明专利]可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离方法和用途

权利要求书

1.一种可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述噬菌体头部呈现正六边形外廓，直径48nm～51nm，含非收缩性的尾部，宽5nm～8nm、长18nm～21nm，为短尾噬菌体。

3.一种如权利要求1或2所述的噬菌体的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

随机采集土壤、粪便、鼻拭子样品以及健康猪群的粪便样品，制备样品的无菌滤液；

将所述无菌滤液进行富集后，得到噬菌体原液；

用所述噬菌体原液，采用双层琼脂平板法，采用耐药性金黄色葡萄球均作为指示菌，筛选噬菌体斑；

对所述噬菌体斑采用双层琼脂平板法分离出噬菌体斑SLPW；

采用液体培养的方法，利用噬菌体斑SLPW制备噬菌体。

4.如权利要求3所述的分离方法，其特征在于，还包括如下步骤：

观察噬菌体的形态，采用磷钨酸负染法，在透射电镜下观察该噬菌体的形态特征；

以金黄色葡萄球菌05L189为指示菌，采用双层琼脂平板法测定该噬菌体的效价；

确定所述噬菌体的裂菌谱；

测定所述噬菌体的理化特性，所述理化特性包括热稳定性、pH稳定性、紫外线灭活实验和氯仿敏感性；

确定所述噬菌体的稳定性，所述稳定性为所述噬菌体分别在室温、4℃、-20℃和-80℃下保存三个月的稳定性；

确定所述噬菌体的液体裂菌效果以及环境抑菌、杀菌效果。

5.如权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述噬菌体原液的制备方法为：取经无菌检验的滤液30mL与等体积的BHI培养基混匀后，加入处于对数生长期的噬菌体宿主菌金黄色葡萄球菌3mL，在37℃、165rpm下振荡培养过夜，次日在4℃、12000rpm下离心15min，取上清30mL，分别加入等体积的BHI培养基和宿主菌增菌液1mL，37℃静置30min后，165rpm振荡培养12h后，4℃12000rpm离心15min。取上清15mL，加入等体积的BHI培养基及宿主菌增菌液0.6mL，室温静置30min，37℃165rpm振荡培养4h；4℃12000rpm离心20min，收集上清并用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到噬菌体原液；

所述噬菌体斑的双层琼脂平板法筛选的具体操作为：分别以9株金黄色葡萄球菌、18株MRSA和VRSA菌株、10株食源性菌株及17株临床分离株共计54株菌株为指示菌，分别取300μL步骤二中富集得到的噬菌体原液，与54株过夜培养的300μL菌液分别混匀，轻轻漩涡振荡后于37℃孵育20min，加入40℃左右的上层琼脂中，混匀后迅速浇注在底层平板—BHI培养基固体平板上，室温放置15min，待其凝固后，倒置于37℃培养箱培养11h～13h，筛选能形成噬菌斑的平板；

所述噬菌体斑SLPW的分离方法为：选取噬菌斑生长均匀的双层琼脂平板，挑取单个噬菌斑，接种于1mL BHI培养基中，37℃培养2h～3h后，4℃、12000rpm下离心10min，收集上清经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存。将该液体做适当稀释，基于双层琼脂平板法，对单个噬菌斑进行上述反复纯化，最终使双层琼脂平板上的噬菌斑形态和大小完全一致，即获得了纯化的噬菌体分离株，为SLPW；

所述噬菌体的效价的测定方法为：将纯化好的噬菌体液用BHI培养基进行适当稀释，采用双层琼脂平板法，取100μL的噬菌体稀释液与等体积的指示菌混匀后倒双层琼脂平板，于37℃培养箱倒置培养11h～13h。选取30个～300个噬菌斑的平板进行计数，最终得出原噬菌体液的噬菌体数，即效价；

所述噬菌体的裂菌谱的确定方法为：分别以20株MRSA和VRSA菌株、20株食源性菌株、20株临床分离菌株、猪链球菌、大肠杆菌参考株MC1061共62株作为指示菌；取300μL培养至对数早期的待测菌株加入45℃左右的上层琼脂培养基中，混匀后倒入预先制备好的BHI固体琼脂平板上，待平板凝固且表面干燥后，取20μL效价约10⁸PFU/mL的噬菌体SPLW滴加至平板表面，待菌液吸收后置37℃培养过夜，观察噬菌体对菌株的裂解情况；

所述噬菌体的热稳定性的测试方法为：将噬菌体原液稀释至10⁸PFU/mL，取1mL于无菌EP管中，分别于25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中作用1h，待作用时间结束后立即取出置于冰上冷却，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价。每个温度做3个重复，实验重复3次；

所述噬菌体的pH稳定性的测试方法为：所选取的pH值梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，分别取0.8mL不同pH值的BHI培养基于无菌EP管中，经37℃水浴10min，待温度平衡后，分别加入0.2mL效价为10⁸PFU/mL的噬菌体，37℃水浴1h后，用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价；

所述噬菌体的紫外线灭活实验具体为：将噬菌体悬浮液置于30W的紫外灯下35cm处1h，每隔10min取样，并将噬菌体进行适当倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。每次取样做3个重复，实验重复3次；

所述噬菌体的氯仿敏感实验具体为：向噬菌体悬浮液中加入5v/v％、25v/v％、50v/v％、75v/v％的氯仿溶液，充分混匀并置于4℃静置，于6h、12h、18h、24h取样，4℃、8000rpm下离心15min，上清用BHI液体培养基进行倍比稀释后，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价；

所述噬菌体的环境杀菌效果测试方法为：取新鲜制备的BHI固体平板，做噬菌体喷雾处理，具体方法如下：将平板分别做噬菌体的喷雾1次、喷雾2次和喷雾3次的处理，对照组喷雾等量的噬菌体稀释液，每个平皿分别于喷雾前或喷雾后涂布适量的MRSA菌株PNB25和DL57-3，于恒温培养箱37℃倒置培养12h后，对每组平板进行菌落计数。