[发明专利]可裂解多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种高效快速杀灭多种耐药性金黄色葡萄球菌的噬菌体及其分离、用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的条件性致病菌，可引起人和动物多种严重的感染性疾病。由于金黄色葡萄球菌多重耐药性菌株的出现，使得对该菌引起感染的治疗变得越来越困难。尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA)菌株的出现，几乎对所有常用的抗生素都表现出极强的耐药性。在此形势下，即使投入大量的人力和资金继续研发新型抗生素，细菌的耐药问题仍无法得到有效解决。因此，寻找有效控制多重耐药菌的新对策十分迫切。

噬菌体通过高效、专一侵染细菌，并在细菌内大量复制并释放而裂解细菌，而且与传统的治疗细菌感染的方法相比，用噬菌体治疗细菌性感染有着很大的优势：(1)使用量极小。噬菌体病毒颗粒在感染细菌后，可迅速以指数数量级增殖，并产生数以万计的子代噬菌体颗粒，而每个子代噬菌体颗粒又可以继续感染其它细菌，再产生上万个子代噬菌体颗粒。如此只需重复几次，在理论上，一个噬菌体病毒颗粒便可以使上亿个细菌感染死亡，从而达到治疗细菌感染的目的。(2)高度地特异性。噬菌体具有严格的宿主特异性，往往只感染某一株或某一类细菌，而对动物或人机体内的正常微生物菌群无影响。(3)细菌不易对其产生抗性。噬菌体可以通过自身基因突变或者基因重组等方式来适应宿主细菌的变异，而传统的治疗方法则不具备这一优势。(4)无药物残留。噬菌体对宿主细菌的特异性和依赖性，从而决定了噬菌体只会在被细菌感染的部位，当宿主细菌被完全杀灭后，噬菌体也将随之死亡，不会导致体内残留的发生。(5)作为治疗细菌感染的噬菌体库丰富。据报道，噬菌体是地球上已发现的最丰富、最多样化的生物体，其在自然环境中含有量高达10³¹个，而传统的治疗方法或治疗药物均是有限的。(6)费用成本低。相比传统方法的治疗药物如新型抗生素药物的研发等需要数年，不仅需要花费数百万美元用于临床实验，而且还不能完全保证其治疗效果，而分离和鉴定噬菌体却是一个费用低、速度快的过程。(7)噬菌体可被用于治疗对抗生素或其他药物治疗过敏的患者。因此，噬菌体疗法是解决现在日趋严重的细菌耐药性的一种可行性方法。而迄今为止，已经被分离和利用的噬菌体数量却非常有限，且大多数噬菌体的环境适应能力差、裂菌谱较窄、裂菌效率低，特别是特异性裂解MRSA菌株的噬菌体国内鲜有报道，本发明的突出优势就是解决了以上这几个问题。

本发明基于双层琼脂平板法，从环境中分离和筛选出金黄色葡萄球菌噬菌体，并研究噬菌体的病毒学特征和生物学活性，获得裂菌谱广、抗MRSA效率强的噬菌体；评估噬菌体的体外裂菌能力及环境杀菌能力。从而为制备新型生物杀菌制剂或环境消毒剂，以及有效防控金黄色葡萄球菌感染，特别是MRSA菌株感染，提供有效的生物材料和基础数据。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的缺陷，提供一种杀灭耐药性金黄色葡萄球菌噬菌体及其分离、用途；具体是一种能够高效裂解MRSA菌株、食源性金黄色葡萄球菌及临床分离株的噬菌体的分离、纯化、理化特性、裂菌条件优化、体外裂菌能力及用途。本发明从环境中分离、筛选具有特定高效裂菌作用的噬菌体，基于双层琼脂平板法，确定其裂菌活性、裂菌谱，以及影响其裂菌活性的最优裂解条件，提供一种能够高效裂解金黄色葡萄球菌的新型裂菌制剂、用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种噬菌体。该噬菌体，头部呈现正六边形外廓，直径约48nm～51nm，噬菌体含非收缩性的尾部，宽约5nm～8nm、长约18nm～21nm，为短尾噬菌体。该噬菌体能够高效裂解不同来源的金黄色葡萄球菌。

第二方面，本发明涉及一种上述噬菌体的分离方法，包括如下步骤：

步骤一：从上海某四个奶牛场中随机采集土壤、粪便和鼻拭子样品以及健康猪群的粪便样品，分别将样品充分溶解于灭菌的PBS溶液中，经低温、高速离心后，除去细菌及其他杂质，收集上清液，经无菌检验后，获得样品的无菌滤液；

步骤二：采用3次富集法，将步骤一所得无菌滤液经3次富集后，制备噬菌体原液；

步骤三：采用双层琼脂平板法，筛选步骤二的噬菌体的指示菌为多种不同来源的金黄色葡萄球菌；

步骤四：采用双层琼脂平板法，分离、纯化步骤三获得的噬菌体SLPW；