[发明专利]净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱及其制备方法与应用

权利要求书

1.净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，其特征在于，由如下方法制备：

a基质制备

每1g琼脂糖凝胶基质粉末溶于1mmol/L HCl中，然后使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b抗体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和磺胺类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗体溶液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2-4h；

c配体封闭

将步骤b处理后的基质转移至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d除去偶联后未偶联上的多余的配体

依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c处理后的基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；

e装柱

用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

2.根据权利要求1所述净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，其特征在于：制备所述抗双氟沙星单克隆抗体的抗双氟沙星单克隆抗体细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.9205。

3.一种净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a基质制备

每1g琼脂糖凝胶基质粉末溶于1mmol/L HCl中，然后使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b抗体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和磺胺类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗体溶液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2-4h；

c配体封闭

将步骤b处理后的基质转移至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d除去偶联后未偶联上的多余的配体

依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c处理后的基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；

e装柱

用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％NaN₃-PBS洗涤，并使用0.01％NaN₃-PBS保存，然后装柱。

4.根据权利要求3所述净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱的制备方法，其特征在于：制备所述抗双氟沙星单克隆抗体的抗双氟沙星单克隆抗体细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.9205。

5.利用权利要求1所述复合免疫亲和柱进行双氟沙星和磺胺类药物检测的检测方法，包括如下步骤：

用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为1滴/秒，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC或LC-MS分析；

高效液相色谱条件如下：

双氟沙星

流动相：乙腈：四丁基溴化铵(0.030mol/LpH＝3.1)＝5：95

检测器：紫外检测器，波长270nm

色谱柱：Cloversil-C₁₈，4.6×150mm

流速：1.5mL/min

磺胺类药物

流动相：甲醇和1.1％乙酸-0.01mol PBS溶液梯度洗脱

检测器：紫外检测器，波长270nm

色谱柱：Cloversil-C₁₈，4.6×250mm

流速：1.0mL/min；

定量

用进样器吸取50μL标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。