[发明专利]净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种净化双氟沙星和磺胺类复合免疫亲和柱的制备与应用，更确切的说是双氟沙星和磺胺类免疫亲和柱的制备方法，免疫亲和柱净化-液相色谱法检测双氟沙星和磺胺类检测方法的建立。

背景技术

随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography,IAC)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。

双氟沙星(difloxacin，DIF)是美国Abbot公司1984年合成的第三代氟喹诺酮类抗菌药物。双氟沙星具有广谱抗菌作用，对多种革兰氏阴性、革兰氏阳性菌、球菌及支原体等均有较强的活性，加之其在体内分布广泛、与其他抗菌药物无交叉耐药性，已被广泛应用于细菌性疾病的防治。然而由于抗菌药物的滥用会引起药物残留在食品动物体中，从而导致食用此类动物后，引起人类病原菌对抗菌药物产生耐药性，而其产生的毒副作用还会对人体产生直接的危害，如过敏、溢血、肾衰等不良反应。

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，一般为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦。磺胺类药物是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物，种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几十种。SAs作为一类广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗感染性疾病，由于其性质稳定，制造不需粮食做原料、产量大、品种多、价格低、使用简便、供应充足等优点，兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物广泛应用。但是磺胺类药物会影响人的泌尿系统功能，引起过敏性反应，甚至可能致癌。近年来，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中的残留所引起的对生态环境污染和人类健康危害构成的潜在威胁已备受关注，成为人类亟待解决的问题之一。

目前检测双氟沙星的方法主要有毛细管电泳法、酶联免疫法、分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法等；检测磺胺类药物的方法主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等。这些方法的前处理常利用液-液分配，常规的SPE柱精华和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。

免疫亲和技术是上世纪90年代在分析领域得到应用的新技术，免疫亲和层析方法的关键在于选择一种高效特异的抗体，但是，利用现有技术中的液液提取、固相萃取、加热蒸发浓缩等方法的添加回收率均较低，对后续的检测步骤造成很强的基质效应，并且现有技术中没有能够同时纯化待处理基质中16种磺胺类药物的免疫吸附介质，也没有能够同时纯化待处理基质中双氟沙星和16种磺胺类药物的免疫吸附介质，更无商品化的IAC柱出售，能够同时纯化分析多种抗菌药物显然能够提高检测的效率。

发明内容

鉴于以上现有技术中的不足，本发明提供了一种可同时净化双氟沙星和磺胺类药物的免疫亲和色谱柱以及其制备方法，利用该方法制备出性能稳定、特异性强的免疫吸附剂，并建立一种经济、快捷、精确、安全，并且能同时纯化双氟沙星和16种磺胺类药物的方法。

本发明采用的技术方案是：净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，由如下方法制备：

a基质制备

每1g琼脂糖凝胶基质粉末溶于1mmol/L HCl中，然后使用1mmol/L HCl洗涤15min；

b抗体偶联

使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO₃pH8.3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和磺胺类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗体溶液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2-4h；

c配体封闭

将步骤b处理后的基质转移至0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h；

d除去偶联后未偶联上的多余的配体