[发明专利]一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法

权利要求书

1.参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：

步骤一、拟定化学成分鉴定分析条件步骤

运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱方法，运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-DAD-Q/TOF)技术，拟定的分析条件；

步骤二、获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分步骤

根据步骤一中所拟定的化学成分鉴定分析条件，分别吸取对照品溶液和参芎葡萄糖注射液供试品溶液进样测定，获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图；

步骤三、化学成分结构鉴定步骤

针对步骤二所获取的参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图来鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中所含有的化学成分的特征；其中一方面，通过步骤二的对照品溶液比对试验，分析步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中已知化合物的结构；另一方面，通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液的未知化合物结构；

步骤四、心肌细胞萃取实验步骤

利用固相萃取小柱富集纯化，制备参芎葡萄糖注射液样品，选择与参芎葡萄糖注射液样品临床适应症心血管疾病相关的H9c2心肌细胞作为载体进行心肌细胞萃取，制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液；

步骤五、活性成分筛选步骤

运用超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)技术，拟定的分析条件，分别对步骤四的参芎葡萄糖注射液样品、细胞萃取空白对照溶液、细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液进样分析；应用多反应监测(MRM)的离子通道即MRM方式，通过对母离子和子离子特异性的跟踪监测，筛选出参芎葡萄糖注射液中能与心肌细胞有相互作用的成分，即为参芎葡萄糖注射液中具有心血管作用的潜在活性成分；

所述步骤二中，所述拟定的分析条件具体如下：

1)拟定UPLC液相条件：色谱柱：Agilent Plus Plus C₁₈柱，2.1mm×100mm,1.8μm；柱温：20℃；流速：0.30mL·min^-1；流动相：0.1％甲酸乙腈A-0.1％甲酸水B；梯度洗脱条件：0～18min，5％～62％A；18～19min，62％～100％A；进样体积：1μL；

2)、拟定Q-TOF质谱条件：采用电喷雾电离源ESI；在负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z 50～1000；毛细管电压2800V；雾化气N₂，雾化气压力1.2Bar；去溶剂气N₂，去溶剂气流速8L·min^-1，去溶剂气温度200℃；质谱数据采集及处理软件为Compass1.2；

所述步骤四中，所述参芎葡萄糖注射液样品制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液100mL，经减压浓缩至小体积，用1mol/L的盐酸溶液调节供试品溶液pH值至3，经Oasis HLB固相萃取小柱纯化，先用水洗脱以除去供试品中的糖类成分，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液减压浓缩得到浸膏，将浸膏用水溶解至浓度为2mg/mL得到参芎葡萄糖注射液样品；所述Oasis HLB固相萃取小柱是用5mL甲醇活化Oasis HLB小柱，用2mL水冲洗至无醇味后上样；

所述步骤四中，所述制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液的制备方法如下：

(1)DMEM培养基的配制

每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3.7g NaHCO₃，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/mL的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为7.0-7.2，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用；

(2)H9c2心肌细胞的培养

取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37℃水浴中迅速溶解后移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养；生长2～3d细胞达到融合时用0.25％胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA配制的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养；取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6-8×10⁵个/mL接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后得到H9c2心肌细胞；用于实验；

(3)细胞萃取实验

①选择步骤(2)制备的胞浆饱满、生长状态良好的H9c2细胞接种到6孔板中，实验首先用经37℃温浴的PBS A轻轻冲洗细胞表面，去除残留在细胞表面的死细胞及杂质，弃去PBS A，加入2mg/mL的参芎葡萄糖注射液样品，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养45min后，倒掉药液，用PBS A轻轻浸洗3次，每次3min，而后继续用水清洗3次，每次1.5min，留下最后一次清洗液经0.22μm滤膜过滤，作为细胞萃取阴性对照溶液；

②将清洗过的细胞用75％乙醇超声处理20min，使细胞膜上受体变性释放化合物，然后用显微镜检查，以确保其充分溶解，裂解物以10000rpm离心10min，而后将上清液合并，在真空下除去溶剂后，将获得的粘性浓缩物溶入5mL甲醇中，然后将溶液转移到epp管中，氮气流平稳干燥，并将之溶解在0.5mL甲醇中，经0.22μm滤膜过滤即为参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液；

③不加药物，以PBS A代替参芎葡萄糖注射液样品，同法操作进行空白对照试验，制得细胞萃取空白对照溶液；

所述步骤五中拟定的分析条件为拟定UPLC-ESI-MS/MS分析条件，具体如下：

UPLC液相条件：色谱柱：Waters BEH C₁₈，2.1mm×100mm，1.7μm柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C₁₈，2.1mm×5mm，1.7μm；柱温：45℃；流动相：0.1％甲酸乙腈A-0.1％甲酸水B；流速为：0.30mL·min^-1；梯度洗脱条件：0～5min，5％～15％A；5～26min，15％～100％A；3.0～4.0min，90％～5％A；进样体积：1μL；进样器的温度：15℃；

(2)拟定的UPLC-MS/MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电离电压：3kV；离子源温度：120℃；去溶剂气：N₂，流速650L/h，去溶剂气温度：350℃；反吹气：N₂，流速：50L/h；碰撞气：氩气，流速：0.16mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测(MRM)，离子对条件见表1；

表1 质谱条件