[发明专利]一种启动子及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种启动子及其应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓塞性疾病，与其它溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可以口服、半衰期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代理想的预防和治疗栓塞的新型药物。但因纳豆激酶野生菌的产酶量低，严重限制了其发展，因此提高纳豆激酶的产酶量具有很好的研究价值。

枯草芽孢杆菌表达系统被认为是GRAS级的有机体，它没有明显的密码子偏好性，可将功能性蛋白分泌到培养基中，分离纯化工艺简单，目前被广泛用作异源蛋白表达的宿主菌。枯草芽孢杆菌应用的最为广泛的宿主菌是枯草168菌株以及枯草168系列的突变株(如WB600，WB700，WB800等)，本发明中选择使用的宿主菌是胞外蛋白酶活性较低的枯草芽孢杆菌WB800、WB600。

基因表达体系是一个复杂的过程，目前枯草表达系统还不是很成熟。近年来，科研工作者在枯草芽孢杆菌分泌表达外源蛋白方面取得很大的进展，已建立一个有效的外源蛋白枯草表达系统。而在载体系统的改造过程中，启动子调控元件起着重中之重的作用，选用强启动子可以使克隆基因高水平表达。因此，从启动子出发，设计强启动子元件，构建成熟高效的枯草表达系统，无论是在理论研究还是实际生产中都有十分重要的意义。

目前国内外研究学者大多采用对启动子的核心元件进行点突变。本发明采用的是对启动子自身的核心元件进行直接串联改造，既避免了启动子长度可能对转录造成的影响，又提高tRNA与启动子结合的能力，但并不是所有根据该方法设计的启动子的性能都会有所提高，这与启动子自身的核心元件序列密切相关。

本发明通过对启动子的改造，提高启动子活力，实现了外源蛋白的高效表达。本发明中原始启动子P_HpaII控制的纳豆激酶表达的纤溶酶活为120FU/ml，经改造过后新启动子P_{d(-35～-10)HpaII}控制下，纳豆激酶表达的纤溶酶活提高为200.83FU/ml。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新型启动子以及利用该启动子在枯草芽孢杆菌WB600或WB800中高效表达重组纳豆激酶的方法。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明以强启动子基因序列为基础，采用对启动子基因的核心元件进行串联的方式得到一个新的启动子，提高tRNA与启动子结合的能力，进而提高启动子活力。该方法构建的新的启动子有效的提高了异源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量。

本发明的第一个目的是提供一种新型启动子。所述新的启动子是采用在原启动子的-10区后插入一段基因序列，该基因序列是原启动子的-35区上游10bp的碱基序列至-10区(包括-10区)序列的n次重复(n≥1)。

所述新型启动子，在本发明的一种实施方式中，是P_{d(-35～-10)HpaII}、P_{d(-35～-10)43}/P_{tri(-35～-10)43}、P_{d(-35～-10)gsiB}。分别是以P_HpaII、P₄₃、P_gsiB为初始启动子构建得到的。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)HpaII}，在本发明的一种实施方式中，是在P_HpaII的-10区后插入了如SEQ ID NO.2所示序列。所述P_HpaII的基因序列的-35区(TTTATG)，-10区(TATACT)是σ^A-依赖型的。

所述新型启动子P_{d(-35～-10)43}，在本发明的一种实施方式中，是在P₄₃的-10区后插入了如SEQ ID NO.3所示序列。所述P₄₃的基因序列的-35区(GTGAAA)，-10区(TAAAAT)是σ^A-依赖型的。