[发明专利]稳定高表达OS‑9的细胞株的构建方法和应用

权利要求书

1.稳定高表达OS-9的细胞株在制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中的应用，其特征在于，所述稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法包括：将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：

1)、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；

2)、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；

3)、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；

4)、对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；

5)、以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物；

其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游扩增引物如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：12所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括如下步骤：

以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；

以3个扩增产物为模板，以如SEQ ID NO：1和如SEQ ID NO：4所示序列为引物，进行扩增。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3)中，所述酶切反应的体系为：PacI 0.8-1.2μl，PmeI 0.8-1.2μl，10×buffer 1.8-2.2μl，OS-9基因1.8-2.2μg，ddH₂O补至20μl。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤3)中，所述连接的过程中采用T4DNA连接酶，且反应温度为15-17℃。

7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，在步骤5)中，具体包括：

a)、将plenti6.3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6.3-OS-9质粒；

b)、将所述稀释后plenti6.3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25分钟，得到DNA与转染试剂复合物；

c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38℃、4-6％的CO₂的条件下分段培养90-100小时后，离心，过滤，得到病毒液；

d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高表达OS-9的细胞株。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤c)中，所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；所述过滤的过程中，滤径为0.4-0.5微米。

9.权利要求1-8任一项所述的应用中构建获得的稳定高表达OS-9的细胞株在制备通过提高claudin-1和occludin的表达量增强肠粘膜屏障功能的药物中的应用。