[发明专利]稳定高表达OS‑9的细胞株的构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法和应用。

背景技术

肠粘膜屏障是机体防御的重要屏障，可防止肠腔内致病性抗原(细菌、有毒物质、食物抗原物质、致癌物质等)侵入，使机体内环境保持相对稳定，维持机体的正常生命活动。

肠上皮细胞间的紧密连接蛋白是构成肠粘膜屏障的重要组成部分。一旦紧密连接蛋白受到破坏，肠上皮细胞间通透性便增加,细菌、内毒素和大分子物质就可通过紧密连接蛋白进入体循环，参与多种疾病的发生发展。

大量研究表明在烧伤、创伤、大型手术等外科应激条件下，会引起肠道的急性缺氧，从而导致肠粘膜屏障功能障碍，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征，导致多脏器功能衰竭，甚至危及生命。

骨肉瘤蛋白(os-9)是在人体组织广泛表达的一种蛋白，但其功能尚不完全明确。目前对os-9的研究主要集中于它从内质网向高尔基体转运一些膜蛋白，以及在缺氧条件下调节缺氧诱导因子。然而os-9在表达的过程中，其可能会伴随着一系列的刺激和诱导作用，并促使一些未知蛋白(包括一些对机体防御功能有利的蛋白)表达量提高；因此通过研究os-9的表达状态，进一步地探究其对其他对机体防御功能具有帮助的功能性蛋白的表达情况为人们对疾病治疗和防御开辟了新的路径。

然而，目前还未见有通过os-9过表达探究肠粘膜屏障保护作用的相关报道，因此提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法并进行应用是人们亟需解决的一个技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，该方法实现了高表达OS-9的细胞株的构建，为通过研究OS-9高表达探究对机体防御功能具有帮助的功能性蛋白的表达情况提供了实验材料。

本发明的第二目的在于提供上述的表达OS-9的细胞株的构建方法构建成的细胞株的用途。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，包括将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。

该方法构建的细胞株，其能够实现OS-9的过表达，进而为在研究OS-9过表达过程中，其他功能蛋白表达状态提供了良好的实验材料，而且该细胞株表达OS-9稳定，可很好地用于定量和定性检测OS-9高表达状态下相关蛋白的表达状态；此外，该构建方法由于载体、供体细胞以及宿主细胞等选择合理，进而使得稳定高表达OS-9的细胞株易于获得，且获得的细胞株性能稳定，易于贮存。

可选的，该构建方法具体包括以下步骤：

1)、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA；

2)、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；

3)、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6.3载体进行连接，并导入DH5α感受态细胞中进行转化，得到转化后DH5α；

4)、对转化后DH5α进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；

5)、以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。

可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物；

其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；所述下游扩增引物如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：12所示。

通过特定序列的引物，以实现不同位置OS-9基因片段的扩增，上述所举几种引物，由于酶切位点设置合理，同时序列选择得当，非常便于全长OS-9序列的扩增以及后续连接反应的顺利进行。

可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括如下步骤：

以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；