[发明专利]小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白组学研究领域，尤其涉及小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法。

背景技术

生命科学研究已经进入生命整体水平研究的组学时代，随着基因组学研究的展开，研究者发现，基因作为遗传信息的载体只能决定生命体的基本形式，现在获得的基因组知识还不能告诉我们基因在生命体中的作用和如何发挥作用，而基因表达的产物蛋白质是生命功能的真正执行体，因此要想深入了解基因及功能还需要从蛋白质水平进行诠释和解读。但基因和蛋白质表达量并不存在严格的线性关系，蛋白质的表达具有时间和空间的特殊性，其复杂程度和数量远高于基因。生物体内的蛋白质的复杂性大大增加了蛋白质样品制备的难度，因此，蛋白组学研究中以蛋白样品制备最为关键，决定着蛋白质组学研究的成败和结果的好坏。

小鼠是使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物，广泛用于药物毒性、药物筛选和放射生物学实验，因此，发现小鼠脑组织蛋白质组表达的差异变化是研究药物和放射生物学效应的分子机制的重要途径，可为人类脑组织病变的药物筛选、药物靶标发现、治疗和辐射防护提供研究基础。

目前，小鼠采用劲椎脱臼的方法处死并分离脑组织，然后用生理盐水清洗脑组织以去除血液对脑组织的污染。之后将脑组织与含有高浓度尿素的蛋白裂解液直接混合后进行匀浆，离心后上清即为蛋白质组样品【Yijian Zhanga,Yi-Hsuan Pana,Qiuyuan Yina,et.al.Critical roles of mitochondria in brain activities of torpid Myotis ricketti bats revealed by a proteomic approach.Journal of Proteomics, 2014,105(13):266-284.；María Ángeles Peinadoa, Raquel Hernándeza, Juan Peragónb,et.al.Proteomic characterization of nitrated cell targets after hypobaric hypoxia and reoxygenation in rat brain.Journal of Proteomics,2014,109(23):309-321.】。但上述文献公开的方法存在：

⑴无摘取脑组织前去除血液的步骤，样品有血液污染。

上述文献处死小鼠的方法为颈椎脱臼法，然后摘取脑组织并用生理盐水清洗脑组织表面血液，之后进行脑组织蛋白质组蛋白样品的制备。这种方法即使经过多次生理盐水清洗，也只能冲洗脑组织表面的血液，并不能彻底去除脑组织内部的血液。

由于血液中的白蛋白和免疫球蛋白也是蛋白，而且表达丰度非常高，如果不处理干净血液，就会严重污染脑组织的蛋白样品，进行蛋白质组分析时，血液不仅会影响蛋白样品的定量、分离，还会覆盖脑组织中极为重要的低丰度蛋白。蛋白样品制备过程中，也可采用去除血液中白蛋白和免疫球蛋白IgG的试剂盒，但试剂盒价格昂贵，可处理样品体积小，而且处理过程中会造成蛋白丢失。

⑵无对蛋白样品加热增加溶解性的步骤，蛋白提取效率不佳。

蛋白样品在100℃的高温条件下与高浓度SDS缓冲液作用，会增加蛋白的溶解性。但含有尿素的蛋白裂解液的温度却不能超过37℃，否则尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯通过氨基甲酰化（carbamylation）对蛋白质进行修饰，造成人为的“斑点串联”，影响蛋白质样品的分离和鉴定。因此按照该方法，无法对样品进行热处理增溶。

⑶无专门去除脑组织中脂类物质的步骤，导致脂类影响蛋白分离，蛋白质点减少。

脑组织中含有大量脂类物质，如果不去除脂类物质，进行蛋白质组分析时，粘稠的脂类物质就会堵塞凝胶孔，阻止蛋白进入，造成蛋白质点减少，凝胶背景深等不佳效果。

⑷无去除盐离子的步骤，影响电泳电压。

蛋白质组分析，在等电聚焦电泳步骤，电压最高可达10000v，要达到高电压，就要求溶液中盐离子非常低，否则电压上不去。较低电压会延长等电聚焦时间，造成等电聚焦失败或者降低蛋白分离效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种经济、高效去除小鼠脑组织血液、脂类影响，并增加蛋白样品溶解性的小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，包括以下步骤：