[发明专利]促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法

权利要求书

1.原代细胞培养专用血清在诱导小鼠骨髓造血干细胞(HSC)定向分化为T细胞中的应用，其特征在于：所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨髓HSC为小鼠骨髓HSC。

3.一种利用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，加入经免疫磁珠分选后的骨髓Lin-细胞，用含20％(体积百分数)原代细胞培养专用血清的IMDM培养基将骨髓Lin-细胞悬起，调整骨髓Lin-细胞终浓度为1×10⁵个/mL，接入培养板中，加入终浓度为5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

(2)培养48h后，培养板中的细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中，350g离心6min收集细胞沉淀；

(3)用含20％原代细胞培养专用血清的IMDM培养基悬起细胞沉淀，调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取2ml细胞悬液，接入新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

所述新的OP9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的：OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，即得；

(4)每3～4天更换一次新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；培养13～20天，骨髓Lin-细胞即定向分化为T淋巴细胞，即得T细胞；

所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。