[发明专利]促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法。

背景技术

造血干细胞(HSC)主要存在于骨髓、胚胎肝脏、脐带血及外周血中，是能分化发育成各系血细胞的最原始细胞，具有高度自我更新、扩增和定向分化的潜能。目前，HSC移植是血液系统疾病、肿瘤、先天遗传性等疾病最有效的治疗方法，因此，HSC的相关基础研究为人类干细胞的开拓应用奠定了理论基础。小鼠HSC的实验模型主要有体内造血重建、体外克隆形成及诱导定向分化等方法。在体外克隆形成及诱导定向分化等实验中，血清的质量是影响HSC扩增生长状况的重要因素，此类实验对血清的质量要求较高，采用何种血清培养HSC且成功诱导其定向分化是研究难点之一。

发明内容

针对上述研究领域，本发明提供了一种促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法，通过该方法可明显促进小鼠骨髓造血干细胞定向分化为T淋巴细胞。

本发明是通过以下技术方案实现的：

原代细胞培养专用血清在诱导骨髓造血干细胞(尤其是小鼠骨髓造血干细胞)定向分化为T细胞中的应用，所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的：将胎牛脐带血(无菌采集得到)室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1μm微孔滤膜过滤除菌并分装，-20℃保存即可。

一种利用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞(尤其是小鼠骨髓造血干细胞)定向分化为T细胞的方法，步骤如下：

(1)OP9-DL1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，加入骨髓Lin-细胞(骨髓造血干细胞)，用含20％(体积百分数)原代细胞培养专用血清的IMDM培养基将骨髓Lin-细胞悬起，调整骨髓Lin-细胞终浓度为1×10⁵个/mL，接入培养板中，加入终浓度为5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

(2)培养48h后，培养板中的Lin-细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中，350g离心6min收集细胞沉淀；

(3)用含体积分数20％原代细胞培养专用血清的IMDM培养基悬起细胞沉淀，调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取2mL细胞悬液，接入新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

所述新的OP9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的：OP9-DL-1细胞用含10％(体积分数)胎牛血清的α-MEM培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为1×10⁵个/mL，取1ml接种于12孔板中，当细胞融合率达80～90％时，吸弃上清，即得；

(4)每3～4天更换一次新的OP9-DL1单细胞层(更换方式为步骤2、3所述的方法)，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；培养13～20天，小鼠骨髓Lin-细胞即定向分化为T淋巴细胞，即得T淋巴细胞。

所述骨髓造血干细胞(小鼠骨髓造血干细胞)是通过以下方法得到的：

(一)骨髓单个核细胞的获取：

1)取新鲜处死的动物(小鼠)，分离四肢并剥离表皮后于1×PBS中，剪其双脚后用纱布包裹揉搓除去胫骨及股骨所粘附的肌肉组织；

2)将分离的胫骨及股骨用1×PBS清洗两遍，剪断两端使骨髓腔相通；

3)用注射器将骨髓腔中骨髓冲出，反复冲洗直至骨髓腔变白；

4)将冲出的骨髓细胞悬液过200目钢网，去除残余的骨组织或其他残渣；

5)细胞悬液收集到离心管中，1200rpm，10min，4℃离心，同样条件1×PBS再洗一次；

6)红细胞裂解液裂解红细胞，1×PBS洗一次，离心，细胞沉淀即为骨髓单个核细胞；

(二)免疫磁珠分选Lin-细胞：

1)将上述所获骨髓单个核细胞悬液离心，300g，10min，弃上清；

2)细胞沉淀每10⁷细胞加入40uL PBE缓冲液；