[发明专利]一种金纳米粒子探针的制备及其在快速免疫检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测分析领域，尤其涉及一种金纳米粒子探针的制备及其在快速免疫检测中的应用。

背景技术

蛋白质的快速、准确分析是临床诊断、蛋白质组学、制药以及生物学等领域的一门主要学科。依赖于抗原-抗体相互作用的免疫测定被广泛应用于蛋白质的分析。为了检测目标分析物，各种各样不同的标记物被引入到这种免疫分析中，例如荧光团、放射性同位素、电化学发光标记、拉曼标记、DNA条形码以及酶等。在这些信号传感器中，酶联免疫吸附法(ELISA)作为临床检测的黄金标准，通过颜色的变化来检测分析物的含量，这些颜色的变化通过肉眼就可以识别，因此不需要借助于先进的仪器来进行分析。

尽管在蛋白检测中已经取得了相当大的进步，但是基于ELISA检测的诸多方法仍然面临很多的挑战。首先，目标蛋白的捕获抗体在二维表面上是被随机固定的，这常常会导致待检测物不能够充分的被固定的抗体所捕获，因而影响检测的灵敏度。第二，所标记酶的活性对所处的环境条件非常敏感，使得ELISA试剂盒在运输、储存和使用过程中造成不便。第三，在典型的ELISA检测中，多步的孵化和清洗是不可避免的，因此，整个ELISA通常需要几个小时到几天的时间才能得到分析结果。这些缺点使得ELISA不适和作为及时诊断的方法。

发明内容

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种用于快速免疫检测的金纳米粒子探针的制备及其在蛋白检测方面的应用。所述金纳米粒子探针通过PEG-NHS将待测物质对应的抗体与胶体金相结合，然后用于检测蛋白等大分子物质。本发明中利用控制金纳米粒子探针的生长来改变金纳米颗粒之间的距离，从而产生颜色变化来进行蛋白分析物含量的测定。主要特点是整个检测过程是一个不需洗涤、无酶标记的均相检测体系。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于快速免疫检测的金纳米粒子探针的制备，具体步骤如下：

1)向柠檬酸根保护的胶体金(AuNPs)中加入PEG-NHS，室温下反应，PEG-NHS会通过Au-S键固定到金的表面从而形成PEG保护的金纳米粒子(PEG-AuNPs)；得到的PEG-AuNPs离心，将沉淀物重新分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中，如此重复两次；

2)将抗体(Ab)与PEG-AuNPs在低温下孵化过夜，Ab会通过与金上的PEG反应从而与金相连接，得到Ab-AuNPs；接下来，向反应混合物中加入磷酸盐缓冲液；将金上没有与抗体反应的PEG失活；上述体系在室温下反应离心，将沉淀物分散在去离子水中，制备得到用于快速免疫分析的金纳米离子探针。

步骤1)所述PEG-NHS具有如下结构

步骤2)所述的抗体是能够特异性识别待检测抗原的抗体。

步骤1)所述胶体金与PEG-NHS的摩尔比值为1:1-50000；室温下反应时间为0.5-10h；离心的转速为10000-14000r/min，离心时间为10-30min；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.2-7.4。

步骤2)所述抗体与PEG-AuNPs孵化温度为2-10℃；磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为8.5，室温下反应时间为0.25-5h；离心的转速为10000-14000r/min，离心时间为10-30min。

本发明同时提供了一种将金纳米粒子探针用于快速检测蛋白的方法，包括如下步骤：

将上述方法制备的金纳米粒子探针(Ab-AuNPs)与已知不同浓度的抗原进行孵化；将金的生长液加入到上述孵化液中；然后，用微孔板读数器读取它们在525nm处相应的吸光度值，将抗原的浓度值与它们的–ΔA₅₂₅做线性拟合，(ΔA₅₂₅＝A–A₀，其中A是向Ab-AuNPs溶液中加入待检测抗原和金的生长液以后在525nm处的吸收，A₀是只加入金的生长液后在525nm处的吸收)，根据所得直线方程可以得到未知浓度的待检测抗原。

由于蛋白的尺寸比较大，用蛋白使金纳米粒子聚集后离子间的距离比较大，所以不会产生明显的颜色变化。本发明中通过加入金的生长液来控制金纳米粒子探针的生长，从而改变金纳米颗粒之间的距离，产生颜色变化来进行蛋白分析物含量的测定，整个检测过程示意图如图1所示。

本发明所述Ab-AuNPs与已知浓度蛋白的摩尔比值为1:0-400；加入待检测蛋白后的孵化温度为37℃，孵化时间为0.5-2h；金的生长液是终浓度分别为20mM的盐酸羟胺和120μM的氯金酸溶液的混合液。