[发明专利]一种乳牙牙髓干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种牙髓干细胞的培养方法，尤其是涉及一种乳牙牙髓干细胞的培养方法。

背景技术

2003年Miura等在脱落乳牙的牙髓组织中发现了一种多潜能干细胞，与骨髓间充质干细胞和恒牙牙髓干细胞相比，其具有更高的增殖率、细胞群倍增能力、克隆形成能力及高度分化能力，将其命名为乳牙牙髓干细胞(stemcellsfromdeciduousteeth，SHED)。人乳牙牙髓干细胞是间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)的一种，具有自我复制能力和多向分化潜能的间充质干细胞，可以诱导分化成为牙本质、成骨细胞、软骨细胞、成脂细胞、神经细胞、肝细胞、肌细胞等。

人类有20颗乳牙，在乳恒牙交替期会逐渐自然脱落，因此牙髓组织来源非常易得，且无创伤。牙髓组织源于自体组织，无免疫排斥反应，具有较高的安全性。鉴于以上所述生物学特性，牙髓干细胞在治疗骨和牙组织再生修复、神经系统疾病及肌肉萎缩、免疫系统疾病、皮肤外伤、肝脏疾病等方面有广阔的应用前景。

申请号为201210514497.X的中国专利公开了一种牙髓干细胞的规模化生产工艺。文中有如下表述：步骤(1)中，牙髓组织是在无菌条件下挑选的，用缓冲液冲洗后剪碎；牙髓组织的消化采用5-10倍体积的0.1％-0.6％胶原酶，于37℃培养箱中振荡培养30-180min后用含胎牛血清的细胞培养液终止消化，所述细胞培养液选自商品化的含10-20％胎牛血清的D-MEM、DMEM培养基及无血清培养基。然而该方法酶解时间过长，组织消化过度,牙髓干细胞细胞获取数量少。而且该方法采取含胎牛血清的DMEM培养，胎牛血清具有污染源性，批次间稳定性差，不利于细胞用于动物模型中。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，本发明所述培养方法培养的细胞形态良好，呈现梭形、簇团性生长趋势，细胞活性高，简单经济，可获得大量高纯度乳牙牙髓干细胞，且能保持乳牙牙髓干细胞良好的干细胞特性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10-20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，加入细胞悬液重悬细胞并调整细胞密度，于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养，当细胞生长至80％-90％融合时，用含胰蛋白酶的消化液消化细胞后传代培养；其中所述细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子组成。

本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法采用I型胶原酶在37℃酶解消化牙髓组织10-20min可获得较多细胞数量。同时本发明所述培养方法全程采取无血清培养培养及传代，避免采用胎牛血清的DMEM培养基培养。

在一些实施方案中，本发明所述培养方法所述I型胶原酶的加入量为牙髓组织的10-20倍体积。

在一些优选实施方案中，本发明所述培养方法中所述I型胶原酶的浓度为0.3％～0.5％。即3g/L～5g/L。

本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法，所述乳牙可以取自家属同意的儿童因滞留而拔除的没有牙体牙髓病变及坏死的乳切牙，拔除后立即放于4℃遇冷的装有含有双抗的PBS离心管中保存，24小时内取出使用。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。

本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法所述牙齿预先用含双抗的PBS溶液反复冲洗三次，将牙齿包在无菌纱布中用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织。

本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法中所述牙髓组织根据牙髓组织大小，用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm³。

在一些实施方案中，所述培养方法还包括对单个离散细胞进行清洗的步骤。

在一些优选实施方案中，所述培养方法所述清洗具体为离心后用PBS清洗沉淀，离心收集沉淀。在一些具体实施例中，所述离心为1000rpm-2000rpm离心3-5min。

在一些实施方案中，所述培养方法所述单个离散的细胞的直径≤70μm。在一些实施例中，所述获得单个离散细胞的方法具体为吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤。