[发明专利]一种同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用荧光探针和黄嘌呤氧化法测定样品的抗氧化能力，将所要检测的样品与反应体系混合，对反应体系中的荧光探针HE与超氧阴离子的特异性产物2-OH-E⁺的生成量的改变进行测定，根据体系中2-OH-E⁺生成量的减少来计算样品的O₂^-·的清除率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用HPLC法对反应体系中的荧光探针HE与超氧阴离子的特异性产物2-OH-E⁺的生成量的改变进行测定。

3.一种荧光探针耦联液质联用技术同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)缓冲液配制：精密称取KH₂PO₄0.0956g、K₂HPO₄·3H₂O 0.6946g，EDTA 1.862mg，超纯水定容至50mL，即得含75mmol/L磷酸根离子，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

(2)底物的配制：用0.1摩尔/升的NaOH溶液溶解配制40mmol/L的黄嘌呤标准溶液。使用前再加磷酸盐缓冲液稀释即得400 μmol/L底物溶液，底物溶液需每天新鲜配制。

(3)酶的配制：用磷酸缓冲盐溶液配制5U/mL的黄嘌呤氧化酶(XOD)储备液，并保存于-80℃冰箱中；使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成0.08U/mL工作酶液，置于冰上保存；为避免反复冻融降低酶的活性，每次实验前需预估所需酶量，取适量黄嘌呤氧化酶储备液配制成工作酶液。

(4)待测样品的配制：用二甲基亚砜溶解样品配制成100mmol/L的标准溶液，于-20℃条件下避光保存，使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成400 μmol/L溶液，DMSO含量应不超过5％。

(5)荧光探针的配制：在厌氧、避光条件下用二甲基亚砜溶解探针配制成20mmol/L的储备溶液，于-80℃条件下避光保存，使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成200 μmol/L溶液，置于冰上避光保存。

(6)对照品、空白样品和样品的酶促反应

对照品的配制：反应总体积200μL，终浓度0.02U/mL的黄嘌呤氧化酶在37℃下孵育2min，加入终浓度100μmol/L的底物黄嘌呤和终浓度50μmol/L的荧光探针溶液启动反应，37℃下孵育5min后，加入400μL乙腈终止反应，加入终浓度为6μmol/L的内标加兰他敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为对照品，供超高效液相色谱-质谱联用测定。

空白样品的配制：反应总体积200μL，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100μmol/L的底物黄嘌呤和终浓度50μmol/L的荧光探针溶液，37℃下孵育5min后，加入400μL乙腈终止反应，加入终浓度为6μmol/L的内标加兰他敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为空白样品，供超高效液相色谱-质谱联用测定。

样品的配制：反应总体积200μL，将终浓度100μmol/L的样品溶液与终浓度0.02U/mL的黄嘌呤氧化酶在37℃下共同孵育2min，加入终浓度100μmol/L的底物黄嘌呤和终浓度为50μmol/L的荧光探针溶液启动反应，37℃下孵育5min后，加入400μL乙腈终止反应，加入终浓度为6μmol/L的内标加兰他敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为样品，供超高效液相色谱-质谱联用测定。

(7)对照品、空白样品和样品的检测：

对照品、空白样品和样品检测均按下述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测，得到HPLC-MS检测结果：

①所述的高效液相条件如下：

色谱柱：4.6×50mm,1.8μm(Aglient-SB-Aq)

流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈(B)

梯度洗脱程序：0～3min：1％B，3～5min：1～30％B，5～10min：30％B；

流速：1.0mL/min

进样量：15μL

②所述的质谱条件如下：

离子源：电喷雾正离子模式

干燥氮气流速：11L/min

干燥气体温度：300℃

雾化压力：35psig

毛细管电压：3000V

裂解电压：120V

(8)样品对黄嘌呤氧化酶抑制率和超氧阴离子清除率的计算

根据样品的HPLC-MS检测结果

样品对黄嘌呤氧化酶抑制率可以通过HPLC-MS检测结果所显示的反应产物尿酸含量的变化进行评价；样品对超氧阴离子(O₂^-·)清除率可以通过HPLC-MS检测结果所显示的样品能清除反应体系中超氧阴离子而导致的探针与超氧阴离子的特异性产物2-OH-E⁺生成量的改变(减少)进行评价。

化合物对XOD抑制率或O₂^-·的清除率按照以下公式计算：

XOD抑制率或O₂^-·自由基清除率＝[A_blank-A_sample]/A_blank×100％

其中A_blank为对照组尿酸或2-OH-E⁺的峰面积值；

A_sample为样品组尿酸或2-OH-E⁺的峰面积值。