[发明专利]一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法

权利要求书

1.一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR 和β- 巯基乙醇。

2.根据权利要求1 所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于， bFGF 的浓度为12.5~50ng/mL，activin A 的浓度为5~20ng/mL，Y27632 的浓度为2~10nmol/mL，Knockout SR 的体积浓度为2%~5%，β- 巯基乙醇的浓度为20~55 nmol/mL。

3.根据权利要求1 或2 所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，还包括DMEM/F12 培养基、Neurobasal 培养基、N-2 supplement、B-27 supplement、MEM NEAA 和L- 谷氨酰胺。

4.根据权利要求3 所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，其特征在于，

以DMEM/F12 培养基和Neurobasal 培养基按照1:1 的体积比混合作为基础培养液；每20mL 基础培养液中，加入N-2 supplement 50~200μL、B-27 supplement

100~400μL、MEM NEAA 50~200μL、L- 谷氨酰胺100~200μL。

5.一种培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；

（2）猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入步骤（1）经细胞外基质包被的干细胞培养器皿，使用权利要求1~4 任一所述的培养猪滋养层干细胞的专用培养基进行培养；

（3）培养至形成总细胞数为1000~2000 个的克隆团时，消化成单细胞，转入新的步骤（1）经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。

6.根据权利要求5 所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，所述囊胚为人工授精来源的囊胚、体细胞核移植来源的囊胚、体外受精来源的囊胚或孤雌囊胚。

7.根据权利要求5 所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（1）中的细胞外基质为大鼠I 型胶原、基质胶Matrigel 或纤连蛋白。

8.根据权利要求5 所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中的蛋白酶为链酶蛋白酶；囊胚在消化前先用猪胚胎培养液PZM-3 清洗，再转入培养猪滋养层干细胞的专用培养基中清洗；进行培养的环境温度39℃、CO2体积浓度5% 以及饱和湿度。

9.根据权利要求5 所述的培养猪滋养层干细胞的方法，其特征在于，步骤（3）中传代培养的方法为：用DPBS 漂洗，加适量TRYPLE select 胰蛋白酶替代酶消化为单细胞后，加猪滋养层干细胞的专用培养基终止消化，吹打细胞悬浮，收集离心后，用培养猪滋养层干细胞的专用培养基稀释，以1:3 的比例传代至用细胞外基质包被的干细胞培养器皿中。