[发明专利]一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术研究领域，具体涉及一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。医学界称其为“万用细胞”。

动物胚胎早期发育至囊胚时出现第一次细胞分化，形成两种特征和功能各异的内细胞团和滋养层。滋养层干细胞是胎盘组织细胞的祖细胞，逐步分化为滋养层前体细胞、绒毛膜滋养层、合胞体滋养层和多核巨细胞等。胚胎发育早期的表观重编程过程中DNMTs、TETs、HDACs等相关酶共同作用维持滋养层细胞基因组整体低甲基化水平和绒毛膜滋养层的染色质凝聚，参与调节滋养层的分化、迁移和侵入子宫内膜的能力（Logan et al., 2013）。为了揭示滋养层分化发育中如此复杂的分子机制，从早期胚胎分离纯化滋养层干细胞，建立其体外培养的模型是很有必要的。最早从小鼠囊胚滋养外胚层成功分离得到滋养层干细胞，它们在添加碱性成纤维细胞生长因子bFGF和人白血病抑制因子hLIF的环境下能维持自我更新，注射入小鼠囊胚后能嵌合入小鼠胎盘的各个部位，而并不存在于小鼠胎儿的各胚层中（Tanaka et al., 1998; Takahashi and Yamanaka., 2006; Rielland et al., 2008）。其他一些动物的滋养层细胞系也已经建立，包括牛、羊和猪等，这些细胞能进行连续传代培养，表现上皮细胞的特征。然而，有蹄类大动物的滋养层干细胞的细胞增殖和更新相关的关键信号通路与小鼠存在诸多未知差异，这一经典的小鼠滋养层干细胞的培养体系并不适用于家畜和灵长类等大动物的滋养层干细胞的分离培养。不同种类动物的干细胞分离培养所需的生长因子和调控通路存在较大的差异，目前国内外尚无猪的早期囊胚来源的滋养层干细胞成功建系和干细胞特性鉴定的报道。人和恒河猴等灵长类动物由于早期胚胎获取困难的因素，在摸索适宜的滋养层干细胞培养体系研究上将花费更长的时间。这与至今仍无真正意义上的家畜和灵长类的胚胎干细胞成功建系的情况相似。

滋养层干细胞已经在小鼠着床前期和着床后的胚胎中都能分离获得，然而，国内外尚无报道在猪、牛和羊等有蹄类动物中也能获得类似于小鼠中的这种能够增殖更新、具有多能性的滋养层干细胞。猪胎盘来源的滋养层细胞系已经建立，这些细胞能进行连续传代培养，表现上皮细胞的特征，表达分化标记核纤层蛋白A/C，但没有多能干细胞特征（Flechon et al., 1995; La Bonnardiere et al., 2002）。宋志强等（2013）运用小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层细胞，在基础培养液中添加成纤维细胞生长因子FGF4和人白血病抑制因子LIF，从第6天的孤雌囊胚中分离到猪滋养层干细胞样细胞。其试验中培养效率低，约为30个囊胚能获得1个细胞克隆团，在形态上体现了滋养层干细胞特征，但未能证明其干细胞特性，也就是说还没有获得真正的猪滋养层干细胞。李荣凤等（2013）发明了一种牛滋养层干细胞建系方法，是将牛囊胚接种于小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，在培养液中加入小分子抑制剂PD0325901和CHIR99021进行细胞的传代培养。该培养体系是经典的胚胎干细胞培养方法，由此获得的滋养层干细胞是由胚胎干细胞在特定条件下衍生转化而来的一类细胞，与滋养外胚层来源的干细胞可能存在一些本质和潜在特征的区别。

发明内容

为了克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基。

本发明提供的培养猪滋养层干细胞的专用培养基，成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇。以上成分均已经商品化，可以直接购买市售商品，例如其中bFGF、activin A、Knockout SR和β-巯基乙醇可购自Gibco品牌，Y27632可购自Sigma品牌。

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，在胚胎发育和分化的多个生物学反应过程中激活FGF信号通路，是一种在细胞培养中应用广泛的生物活性蛋白。

activin A：激活素A，是细胞因子TGFβ超家族的成员，TGFβ超家族介导的信号通路在维持胚胎干细胞自我更新和特异的分化过程中发生了不同的生物学效应，具体细胞的命运主要依赖细胞接受信号的阶段，以及细胞因子的水平和与其他细胞因子的相互作用。bFGF和activin A 单独长期作用都会诱导干细胞分化，而它们共同作用时却能够维持干细胞的多能性，暗示了它们之间存在着相互调控的机制。