[发明专利]桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其防治桉蝙蛾的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种害虫生物防治菌种，尤其是桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其桉蝙蛾的防治方法。

背景技术

桉树是我国南方引种栽培最广泛的用材林树种，据近来统计数据表明，全国桉树种植面积6000多万亩。桉蝙蛾是近年来发现危害桉树最严重的钻蛀性害虫，仅在广西，每年桉蝙蛾发生危害桉树的面积近5万亩，给桉树种植及其相关产业造成了巨大的经济损失。该害虫的幼虫期长，生活隐蔽，蛀道外有木屑包起防护作用，防治难度相当大，目前生产上还没有找到有效的防治方法。以菌治虫、生物防治是国内外广泛倡导和推广使用的无公害环保害虫防治措施，尤其是对于生活隐蔽、常规防治困难的钻蛀性害虫防治意义更为重大。

发明内容

在对桉蝙蛾天敌系统的调查和研究中，我们发现了一种真菌-桉蝙蛾白僵菌（Beauveria，bassiana (Bals.) Vuill）对桉蝙蛾害虫的致病率较高，能有效杀死桉蝙蛾，控制桉蝙蛾的虫口密度和危害程度。对桉蝙蛾白僵菌分离培养和扩大生产，能有效防治桉蝙蛾，减少害虫灾害，对保护树木具有十分重要的意义。

本发明的目的是提供一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养方法，为防治桉蝙蛾提供优质菌种，达到以菌治虫目的。

本发明的另一个目的是提供一种桉蝙蛾的防治方法，以菌治虫，生物防治，为保护森林和发展林业产业作出贡献。

为达上述目的，本发明的技术方案为:

一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养方法，它包括以下步骤：

（1）采集感病桉蝙蛾，采集桉蝙蛾疑似感染白僵菌自然死亡的虫尸；

（2）筛选病原菌，对采集的桉蝙蛾虫尸在光学显微镜下进行镜检，确定病原菌种类，选取感染白僵菌的虫尸；

（3）初培养，对所选择桉蝙蛾虫尸进行常规的表面消毒，剖切虫尸，取虫尸中间一小块组织移至PDA平板培养基上，封口后置于25℃恒温培养箱内培养7 天，然后取上述PDA平板培养基培养长出菌落边缘部位菌丝体移接于PDA斜面培养基上，25℃恒温箱内培养[微软用户1] ，待斜面培养基上菌种长满后放入4℃冰箱保存备用[微软用户2] ；

（4）单孢纯化，采用稀释纯化法对保存在冰箱中的菌种进行单孢纯化，备用；

（5）形态学鉴定，将所获得的桉蝙蛾白僵菌菌株置于PDA+桉蝙蛾虫体组织培养基上培养，其形态与球孢白僵菌最相似，初步确认为桉蝙蛾白僵菌；

（6）分子学鉴定，不同白僵菌菌株其菌落形态差异较大，根据形态的差异，筛选22个有代表性的菌株进行rDNA- ITS序列扩增，分子测序结果22个菌株的 ITS 序列均与球孢白僵菌序列相似性最高，相似性在98.16%以上。分子鉴定结果进一步确定为桉蝙蛾白僵菌。鉴定结果表明:桉蝙蛾白僵菌（Beauveria，bassiana (Bals.) Vuill）为桉蝙蛾病原真菌的优势类群。通过分离、培养、纯化、鉴定，获得桉蝙蛾白僵菌优势菌种。

利用桉蝙蛾白僵菌防治桉蝙蛾的方法为：

一种桉蝙蛾的防治方法，它包括以下步骤：

（1）取桉蝙蛾白僵菌菌种置于PDA斜面培养7-15天，让其长出大量分生孢子；

（2）将培养好的分生孢子置入一个灭过菌的盛有0.05% -吐温80无菌水的容器中；

（3）在液体快速混合器上充分振荡，3层灭菌的纱布过滤；

（4）将过滤所得分生孢子配制浓度为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液；

（5）于桉蝙蛾幼虫期用注射器将孢子悬浮液注入桉树上的桉蝙蛾蛀道内，或拆开木屑包对蝙蛾蛀道喷雾，每个蛀道注射或喷雾1ml孢子悬浮液。无菌水做对照；

（6）效果检查，白僵菌菌株处理后，每5天检查1次桉蝙蛾幼虫死亡情况，20 天后统计处理组和对照组桉蝙蛾幼虫的累计死亡数量，计算死亡率和校正死亡率，评估防治效果。

上述桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及防治桉蝙蛾的方法，菌种从桉蝙蛾自然死亡虫尸中采集，分离培养后又用于防治桉蝙蛾，以菌治虫、生物防治，是一种无公害、环保和害虫防治有效措施，为保护和发展树林作出了贡献。

附图说明

图1是本发明桉蝙蛾白僵菌分子鉴定的N-J系统发育树结构示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1

1、桉蝙蛾白僵菌菌种的采集