[发明专利]骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用

权利要求书

1.一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨，获取皮质骨骨片，在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片，使细胞从骨片边缘爬出，进入细胞培养板或培养皿，收集贴壁生长的细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

2.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，采用纯机械分离法，获取皮质骨骨片。

3.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片；

5）5天后更换培养基；

6）12-15天后收集贴壁生长的细胞。

4.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成约2mm×2mm的骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）将骨片按每孔6-10片接种于血清包被的6孔板内，每孔加入含有1%L-抗坏血酸、1%双抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培养基5mL，浸泡全部骨片，避免骨片飘起；

5）5天后进行半量换液：留存1-2ml原培养基，补充3ml新培养基；

6）12-15天后进行常规传代，采用6孔板每孔接种1×10⁵个细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

5.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，采用茜素红（Alizarin Red）染色及碱性磷酸酶（ALP）定量分析对所得细胞进行鉴定。

6.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，所述骨质疏松大鼠动物模型的构建方式为：取成年雌鼠用维甲酸按照70mg/kg的给药量胃灌15天；或取成年雌鼠吊尾饲养60天；或取成年雌鼠切除两侧卵巢后，饲养90天；或直接取年龄在24个月以上的雌性大鼠。

7.一种采用权利要求1所述的分离培养方法获取的骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

8.根据权利要求7所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞，其特征在于，所述细胞呈三角形或梭形，轮廓清晰，折光好。

9.一种如权利要求7所述细胞的应用，其特征在于，将其作为筛选骨质疏松药物和/或植入材料的细胞模型。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述细胞与被筛选的对象共培养后，检测细胞的成骨指标。