[发明专利]骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用有效

专利信息
申请号: 201510212133.X 申请日: 2015-04-30
公开(公告)号: CN104789524A 公开(公告)日: 2015-07-22
发明(设计)人: 谢鹏飞;杨晓;樊渝江;朱向东;陈雪宁;谭言飞;张兴栋 申请(专利权)人: 四川大学
主分类号: C12N5/077 分类号: C12N5/077;C12Q1/02
代理公司: 成都九鼎天元知识产权代理有限公司 51214 代理人: 曾晓波
地址: 610064 四川*** 国省代码: 四川;51
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摘要:
搜索关键词: 骨质 疏松 大鼠 原代成骨 细胞 分离 培养 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨,获取皮质骨骨片,在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片,使细胞从骨片边缘爬出,进入细胞培养板或培养皿,收集贴壁生长的细胞,即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

2.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,采用纯机械分离法,获取皮质骨骨片。

3.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)处死模型动物,无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨;

2)用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入,剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板,彻底剔除骨上附着的肌肉组织;

3)在超净台内将皮质骨切割成骨片,弃两端,用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次,并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞,使骨片最终呈现乳白色;

4)在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片;

5)5天后更换培养基;

6)12-15天后收集贴壁生长的细胞。

4.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)处死模型动物,无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨;

2)用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入,剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板,彻底剔除骨上附着的肌肉组织;

3)在超净台内将皮质骨切割成约2mm×2mm的骨片,弃两端,用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次,并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞,使骨片最终呈现乳白色;

4)将骨片按每孔6-10片接种于血清包被的6孔板内,每孔加入含有1%L-抗坏血酸、1%双抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培养基5mL,浸泡全部骨片,避免骨片飘起;

5)5天后进行半量换液:留存1-2ml原培养基,补充3ml新培养基;

6)12-15天后进行常规传代,采用6孔板每孔接种1×105个细胞,即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

5.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,采用茜素红(Alizarin Red)染色及碱性磷酸酶(ALP)定量分析对所得细胞进行鉴定。

6.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法,其特征在于,所述骨质疏松大鼠动物模型的构建方式为:取成年雌鼠用维甲酸按照70mg/kg的给药量胃灌15天;或取成年雌鼠吊尾饲养60天;或取成年雌鼠切除两侧卵巢后,饲养90天;或直接取年龄在24个月以上的雌性大鼠。

7.一种采用权利要求1所述的分离培养方法获取的骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

8.根据权利要求7所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞,其特征在于,所述细胞呈三角形或梭形,轮廓清晰,折光好。

9.一种如权利要求7所述细胞的应用,其特征在于,将其作为筛选骨质疏松药物和/或植入材料的细胞模型。

10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,将所述细胞与被筛选的对象共培养后,检测细胞的成骨指标。

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