[发明专利]骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞技术领域，特别涉及一种骨质疏松大鼠长骨原代成骨细胞分离方法及应用。

技术背景

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种多原因诱发，以骨量的减少和骨组织微量结构破坏为特征的全身性疾病。根据WHO（世界卫生组织）统计，骨质疏松的发病率已跃升到众多常见疾病和多发病的第7位。现在全球每3名妇女和每8名男性中分别有1人患骨质疏松症。在美国，约有1000万人罹患骨质疏松，另有1.4-1.8万人患有骨质减少；在中国，目前骨质疏松症患者已达6300万。骨质疏松症主要出现在绝经后的女性和老年男性中。

骨质疏松会引起一系列的并发症，严重影响着人们的日常生活自理能力。骨折是骨质疏松最为常见和严重的并发症。骨质疏松患者骨与正常骨相比密度低、强度低、骨脆性大，骨折的风险非常高。在美国，每年因骨质疏松导致的骨折约有150万人，不同程度的有椎体骨折、髋部骨折、桡骨远端骨折，约有25%的人死于骨折相关的并发症；在欧洲，50岁以上的人群中有1/8的人因骨质疏松患过脊椎骨折，80岁人群中1/3妇女及1/9的男性因骨质疏松患过髋骨骨折。骨质疏松性骨折存在着终生危险性，据报道，在美国罹患髋骨骨折的妇女中约有60%的人不能回复到骨折前的功能状态，出现不同程度的活动受限甚至是终生活动受限。在老年人中，随着年龄增长，骨质疏松概率越高，且与其骨折发病率呈正相关性。随着全球老龄化加剧，骨质疏松症引发的骨折及其并发症逐渐成为不容忽视的医疗问题。

骨质疏松骨折补位骨量低，且多为粉碎性骨折，所以外科治疗常使用材料植入和抗骨质疏松药物的共同疗法。目前使用的植入材料包括钛、钴合金，羟基磷灰石陶瓷材料等；抗骨质疏松药物主要包括雌激素、磷酸盐类及甲状旁腺素等。每年度约有近百种新材料及抗骨质疏松药物问世。目前国内外实验室广泛地使用大鼠模型来模拟骨质疏松病症，进行新材料及药物检测和评估。但以动物活体作为筛选模型存在着成本高，周期长，细胞学机理不明等传统缺陷。该领域内缺乏一种高效而专一的体外成骨细胞病理模型。

现有的成骨细胞的一般培养方法分为酶消化法和组织块法，主要针对动物胚胎或幼体的颅骨进行胶原酶（Collagenase）消化（孵育时间通常为40分钟以上）配合物理分离，得到一定量的成骨细胞。然而胶原酶消化对于成骨细胞及其膜上的功能蛋白可能存在着不可逆的损伤及改变，消化时间难以掌握，在病理细胞的体外分离中应尽量避免。另外，动物胚胎或幼体的骨组织尚未矿化，且富含多种除成骨细胞之外的细胞，如：软骨细胞，成纤维细胞等，原代培养中难以得到较纯的成骨细胞。再者，对于成年骨质疏松动物四肢骨原代成骨细胞的分离培养方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述问题提供一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用，通过利用大鼠骨质疏松模型，采用纯机械分离法获得原代骨质疏松长骨成骨细胞。所获得的细胞在生化指标方面具有骨质疏松病理特性，并且能够对抗骨质疏松药物及骨诱导材料产生积极响应。本发明建立一种简单而有效的骨质疏松成骨细胞的提取方法。对研究骨质疏松的预防及治疗有重要意义。

本发明从骨质疏松动物模型中获取四肢骨的皮质骨骨片，然后用培养基浸泡骨片通过贴壁法获得骨质疏松动物原代成骨细胞。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨，获取皮质骨骨片，在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片，使细胞从骨片边缘爬出，进入细胞培养板或培养皿，收集贴壁生长的细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。所述四肢骨为股骨或胫骨或腓骨中的至少一种。

作为可选方式，在上述方法中，采用纯机械分离法，获取皮质骨骨片。成功避免了酶消化对于成骨细胞可能存在的不可逆的损伤及改变。

作为可选方式，上述方法包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并通过震荡彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片；

5）收集贴壁生长的细胞。

作为可选方式，在上述方法中，采用茜素红（Alizarin Red）染色及碱性磷酸酶（ALP）定量分析对所得细胞进行鉴定。

作为可选方式，上述方法包括以下步骤：