[发明专利]一种基于脱碱基位点的免标记凝血酶检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用具有脱碱基位点的免标记凝血酶快速检测方法。

背景技术

DNA有着良好的生物相容性，利用分子工程技术制备的DNA分子探针已被广泛应用。脱碱基位点(AP位点)作为DNA的一种损伤类型，已经引起了科研人员的重视。但是，有关AP位点在生命、分析领域方面的应用还比较少。

核酸适配体作为新型功能分子在检测目标分子时有着高灵敏度和高特异性，因而在临床诊断、药物筛选和分析化学等领域得到了广泛应用。当凝血酶与相应的适配体发生作用时，适配体空间构型发生转化生成一个稳定的G四聚体结构。基于适配体的凝血酶检测是当前生命分析化学领域一个活跃的方向，其主要检测方法有光学法和电化学法。

DNA是生物大分子，不具备检测信号，在实际应用时大部分需要对其进行繁琐的官能团标记或修饰。不仅增加了操作步骤，还加大了检测成本。因此，利用AP位点发展免标记的DNA分子探针，将是未来研发的热点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、成本低、操作简单、耗时短的凝血酶检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

一种基于脱碱基位点的免标记凝血酶检测方法，该检测方法是由SEQ ID No:1～2所示序列合成双链DNA，将脱碱基位点和凝血酶适配体同时引入到双链DNA中。

本发明所述的基于脱碱基位点的免标记凝血酶检测方法，其优选的技术方案，包括如下步骤：

(1)具有SEQ ID No:1～2的单链DNA于缓冲溶液中进行退火处理形成双链DNA；

(2)在步骤(1)得到的双链DNA中加入有机配体，混合，5℃下温育5～20min，形成有机配体/DNA复合物；

(3)在步骤(2)的有机配体/DNA复合物中加入含有凝血酶的待测样品，混合，在5℃下温育10～30min，在352nm的激发波长下进行荧光检测。

进一步地，在步骤(1)中所述的退火处理的方法为：由室温缓慢升温至75℃，保持10min，再缓慢冷却至室温。所述缓慢升温或缓慢冷却操作在本领域技术人员处理DNA退火或冷却时的常规操作范围内进行即可。

进一步地，步骤(2)中所述的有机配体为2-氨基-6,7-二甲基-4-羟基蝶啶、2-氨基-4-羟基蝶啶中的一种。

进一步地，步骤(2)中所述的双链DNA与有机配体的摩尔比为3:1～5:1。

本发明上述所述方案中，在步骤(1)中用于溶解DNA单链的缓冲溶液可以采用本领域常规的用于溶解DNA的缓冲溶液，例如二甲基砷酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl等，优选采用二甲基砷酸钠缓冲液。

本发明提供两个由SEQ ID No:1～2所示的DNA单链，其中具有SEQ ID N0:1所示的DNA单链的序列是在凝血酶适配体Apt15(序列为5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3')的3'端延长6个碱基(序列为CGC CGC)的序列，该DNA单链命名为ID₁链。SEQ ID No:2为与ID₁链部分互补的DNA链中引入脱碱基位点的DNA单链(序列为5'-GCG GXG CCA A-3')，所述脱碱基位点为Spacer C3(烯丙基残基)。本发明的技术方案中，将所述具有SEQ ID No:1～2所示序列的DNA单链，经退火处理形成双链DNA，将脱碱基位点和凝血酶适配体同时引入到双链DNA中。在该双链DNA和有机配体进行反应时，有机配体进入双链DNA脱碱基位点处的空腔，形成有机配体/DNA复合物，致使有机配体发生荧光淬灭。继而在该有机配体/DNA复合物中加入含有凝血酶的待测样品时，凝血酶与DNA链中的其相应的适配体(Apt15)相互作用发生构型转换，生成G四聚体结构，进而将有机配体释放到溶液中，发生荧光恢复。根据荧光强度与浓度的对应关系，实现对凝血酶的定量检测。

本发明的有益效果：本发明选取具有SEQ ID No:1～2所示的两个DNA单链，合成双链DNA，将脱碱基位点和凝血酶适配体同时引入到双链DNA中，与以往相比，延长了凝血酶适配体3’端的长度，并在延长部分设计AP位点对应的靶碱基，与SEQ IDNo:1部分相匹配的DNA单链(即SEQ ID No:2)只有10个碱基(含AP位点)，在保证检测灵敏度的同时，节约了检测成本。另外，使用本发明的检测方法对凝血酶的检测特异性高、且该方法避免了传统DNA探针中标记、清洗的操作步骤，节约了检测时间。