[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法

权利要求书

1.一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)单克隆抗体的制备：用纯化的全病毒对6周龄BALB/C小鼠进行3次免疫，取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA的方法进行杂交瘤细胞的筛选，获得单克隆抗体3B2；

对单克隆抗体3B2进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，单抗经过常规的辛酸硫酸铵法纯化后，用SDS-PAGE鉴定单抗的纯度，测定单抗的浓度后，采用简易过碘酸钠法进行单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；

获得纯化的全病毒包括以下步骤：选毒力较强的DHAV-1，通过鸡胚接种进行大量扩增，再通过饱和硫酸铵和密度梯度离心法对扩增的病毒进行浓缩及纯化，紫外分光光度法测定蛋白浓度；

获得纯化的VP1蛋白包括以下步骤：将原核重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，利用IPTG诱导表达，对原核表达产物VP1蛋白通过SDS-PAGE电泳及Western-Blot进行鉴定，表达的蛋白是以包涵体的形式存在；大量诱导表达VP1蛋白，对表达的蛋白进行纯化，紫外分光光度法测定蛋白浓度；

(2)检测步骤：

A.抗原包被：VP1蛋白以100ng/孔包被酶标板，包被缓冲液采用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，4℃过夜作用；包被缓冲液配制：1×碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 0.2756g，NaHCO₃ 0.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.6，4℃保存；

B.洗涤：用含0.05％吐温-20的PBS或PBST稀释液作为洗涤液进行洗涤，在A中的酶标板中加入PBST 200ul/孔，震荡洗涤3-5次，每次5min，甩干；PBS溶液配制：NaCl 4.25g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.178g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；PBST稀释液的配制：每1L PBS加入Tween-20 0.5mL，充分混匀；

C.封闭：用含5％脱脂奶的PBST稀释液作为封闭液，每孔加入200μL，37℃封闭2h；PBST稀释液封闭液的配制：将5g脱脂奶溶解于100mL PBST稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；

D.重复B的步骤；

E.酶标单克隆抗体：酶标单克隆抗体进行1：320稀释后，待检血清进行1∶20稀释后，每孔各加入100μL，37℃作用1h；

F.重复B的步骤；

G.TMB显色：每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色5-15min，每孔加2M H₂SO₄终止液50μL终止反应，测定反应各孔OD450nm值；

TMB显色液的配制：Buffer A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％的H₂O₂0.3mL，加超纯水定容至500mL，4℃保存；Buffer B：EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，四甲基联苯胺(TMB)0.2g，加超纯水定容至500mL，4℃避光保存；使用时，将Buffer A和Buffer B以体积比1：1的比例混合，现配现用；

2M H₂SO₄终止液的配制：将浓H₂SO₄以体积比1:8的比例加入蒸馏水中，混匀冷却至室温即为2M H₂SO₄；

计算血清样品的抑制率(PI)，公式如下：抑制率(％)＝(酶标抗体OD值-样本OD值)×100％/酶标抗体OD值；若PI≥15.21％时，血清为阳性；PI<15.21％时，则判定为阴性；

利用该检测方法对某采集的20份种鸭血清，应用本试验建立的竞争ELISA，进行了DHAV-1抗体的检测，检测结果为：20份血清的抑制率为11.5-71.3％，其中有几份血清的抑制率在临界值15.21％以下，并且检测结果整体上离散度较大，对该批种鸭立即加强免疫一次，免疫后14天，再次采集种鸭血清20份进行检测，检测结果为：20份血清的抑制率为43.2-67.3％，均在临界值以上，离散度明显变小，跟踪其商品代雏鸭，发现该鸭群的后代在鸭病毒性肝炎的高发日龄段内得到了很好的保护，没有出现发生鸭病毒性肝炎。